背景乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一个全球性公共卫生问题。流行病学资料表明全世界约20亿人感染过乙型肝炎病毒。其中约3.5亿感染者为慢性HBV感染。研究表明慢性HBV感染者中相当一部分最终会发展为严重程度不同的慢性肝病及肝硬化。而且慢性HBV感染者原发肝细胞癌的发生率比普通人群高出100～200倍。由于HBV感染宿主谱比较窄及缺乏有效的体外细胞培养系统，极大限制了慢性HBV感染的机制研究。近年来随着HBV转基因鼠模型的建立，已初步证明HBV抗原诱导的细胞免疫应答参与HBV感染引起的肝细胞损伤过程，并认为慢性HBV感染者细胞免疫功能低下是病毒持续存在及炎症反复活动的主要原因。但是目前所得数据中，来自动物的实验研究较多，直接针对慢性乙型肝炎患者不同阶段及慢性无症状HBV携带者T细胞免疫状况的信息并不多。尤其是关于病毒载量浮动、抗原浓度变化对机体细胞免疫的影响了解更少。正确评价慢性HBV感染者的细胞免疫功能的整体状况，将有利于我们制订合理的免疫治疗及抗病毒治疗策略。目的1．通过调查慢性无症状HBV携带者外周血T细胞受体谱型的漂移情况，了解T细胞免疫在其病程中的作用，并探讨T细胞免疫对于慢性无症状HBV携带者免疫耐受形成机制的影响。2．通过分析慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)炎症明显活动期患者T细胞受体(T cell receptor，TCR)互补决定区(complementarities determining region，CDR)3谱型的改变，从整体上了解患者T细胞免疫状态，并结合酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)检测PBMC中HBcAg特异的rIFN分泌细胞数量变化，试图探讨CHB患者肝脏炎症与T细胞免疫应答、T细胞CDR3谱系漂移的关系。如有可能，可望寻找HBV抗原特异性T细胞克隆，为以后的个性化免疫治疗奠定基础。3．通过对CHB患者抗病毒(拉米夫定)治疗前后外周血T细胞TCR CDR3谱型进行比较，试图了解患者在病毒学应答前后其T细胞免疫应答的变化，进一步判断慢性乙型肝炎T细胞免疫是否在病毒载量下降时有所恢复，为制订CHB的抗病毒治疗策略提供理论依据。4．如果慢性HBV感染后不同个体出现单或寡克隆性增生的T细胞克隆，我们将试图对其TCR CDR3区进行基因测序，然后利用分子生物信息软件比较其核苷酸及氨基酸序列，了解克隆性增生的T细胞是否具有均一性，并模拟出其TCR可变区三维空间构型，进一步探讨其TCR CDR3空间结构有无相似性，以期为进一步寻找新的HBV抗原表位奠定基础。方法1．设计并合成人αβT细胞TCR 24个BV(TCRβchain variable gene，TCRBV)家族的上游引物和共用的TCR BC(TCRβchain constant gene，TCR BC)下游引物(FAM标记)；在人TCR BC基因中合成实验对照的TCR BC1、TCR BC2上游引物；选取正常献血员、慢性无症状HBV携带者、慢性乙型肝炎活动期及抗病毒治疗前后患者为研究对象，留取静脉肝素抗凝血10～20ml，应用Ficoll-Hypaque(1.077)法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。提取总RNA，逆转录合成cDNA，利用各BV家族特异性引物，PCR扩增24个TCR BV家族(包含完整CDR3区段的cDNA)，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析，初步了解各BV家族表达情况。2．PCR扩增后，将标有FAM荧光的PCR产物在全自动测序仪及6％聚丙烯酰氨变性测序胶上电泳。电泳过程应用GeneScan软件扫描记录相关信息并进行数据分析，了解TCRαβT细胞CDR3多态性和长度分布，从而判断每个BV家族CDR3谱型的漂移情况及单／寡克隆性增生情况。3．依据TCR CDR3谱型分析结果，如有克隆性增生家族存在，则选取部分单／寡克隆增生的TCR BV家族PCR产物直接进行基因测序，利用分子生物信息学软件DNAtools 6.0及Vector NTI Suite 8.0分析CDR3区的序列。4．采用CPH models 2.0 Serve和IMGT数据库对克隆增生T细胞TCR CDR3可变区进行三维空间构型模拟，并根据空间结构判断各克隆性增生T细胞之间TCR CDR3区空间结构有无相似性，进一步推测克隆增生T细胞的均一性。5．慢性无症状HBV携带者及CHB患者PBMC中HBcAg特异的rIFN分泌细胞数检测应用ELISPOT技术完成，具体按试剂盒说明操作。结果1．4例正常人PBMC中TCR 24个BV家族CDR3谱型分析的RT-PCR产物，在1.5％的琼脂糖凝胶电泳图上显示一条模糊的条带；在6％的聚丙烯酰氨测序胶电泳图上，各TCR BV家族均显示8条以上的条带；GeneScan软件分析显示TCR24个BV家族的CDR3谱型呈高斯(Gaussian distribution)分布，各家族的CDR3表达频率接近，但各家族呈现不同的CDR3多态性和CDR3长度分布。2．9例慢性无症状HBV携带者外周血TCR BV家族CDR3谱系的RT-PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳时，24个BV家族均可见一条模糊的条带。6％的聚丙烯酰胺测序胶上电泳时，多数BV家族可见中间信号强两边弱的多个荧光条带。部分家族呈现单一或两条较亮的条带；部分家族呈现非正态分布的多条亮带；个别家族没有收到荧光信号。GeneScan软件分析CDR3谱型显示，9例患者均有部分家族呈现单峰、寡峰或偏峰谱型，部份家族表达频率极低或缺失；选取的部分单／寡克隆增生家族进行测序，共获得9个特异的CDR3区序列结果。经分子生物学软件分析证实，不同患者来源的CDR3有着不同的序列和长度。9例健康对照及9例慢性HBV携带者HBcAg特异性分泌IFN_γ细胞的计数结果分别为(?)±SD=9.056+2.800和(?)±SD=10.000±2.358。经统计学分析，两组间斑点形成细胞数(spot forming cells，SFC)并无显著差异(t=-0.774，P=0.450)。3．8例炎症活动期的慢性乙型病毒性肝炎患者及4例接受拉米夫定抗病毒治疗的慢性乙肝患者外周血TCR各BV家族经RT-PCR扩增后，在1.5％琼脂糖凝胶上电泳时，24个BV家族同样也可见模糊的条带；在6％的聚丙烯酰胺测序胶电泳图上，多数TCR BV家族显示8条以上条带，部分家族显示少于8条带或荧光条带缺失；GeneScan软件分析显示，12例CHB患者均有部分家族呈现单／寡克隆增生谱型；部分家族呈现多克隆背景上的优势峰，但又不同于正态分布的谱型；个别家族没有检测到荧光信号。对出现单／寡克隆性增生的家族进行TCR CDR3区测序，结果证实这些增生的T淋巴细胞具有不同的CDR3序列。但是对这些序列进一步分析发现，某些T细胞克隆的TCR CDR3区含有共同的氨基酸基序。CHB炎症活动期患者HBcAg特异性分泌IFN_γ细胞读数结果为(?)±SD=21.875±9.062。经统计学分析提示CHB组与慢性HBV携带者组及正常对照组之间SFC均有显著差异(P＜0.05)。4．依据相对荧光密度判断，4例CHB接受拉米夫定治疗前，各病例24个BV家族谱型偏移率分别是29.2％(病例1)、37.5％(病例4)、50.0％(病例3)及41.6％(病例2)，均数为(?)±SD=39.750±8.655；治疗后TCR CDR3谱型虽有变化，但整体谱型偏移率仍较高，4例病人分别为33.3％(病例1)、33.3％(病例4)、54.2％(病例3)、41.6％(病例2)，均数为(?)±SD=40.600±9.875。经统计学配对t检验，治疗前后4例病人TCR CDR3谱型偏移率没有明显差别(t=0.513，P＞0.05)。5．虽然治疗前后的谱型偏移率没有明显的改变，但通过对各家族治疗前后的谱型分析可以看出，4例CHB患者的一些BV家族的TCR CDR3谱型在治疗前后发生了较大变化：部分BV家族治疗前为单克隆性增生谱型，治疗后恢复为正态分布的谱型；部分治疗前为多克隆正态分布谱型，而治疗后出现了单／寡克隆性增生。此外，一些BV家族治疗前为正态分布谱型，而治疗后转换为明显的谱型受限；另一些家族在治疗前谱型受限，但在治疗后恢复转为正态或类正态分布。病例1的BV15治疗前为谱型缺失，治疗后出现了TCR CDR3谱型受限。6．利用CPH models 2.0 Serve和IMGT数据库，对8例慢性乙型肝炎炎症活动期患者及4例慢性乙型肝炎患者接受拉米夫定治疗前后测得的克隆增生T细胞TCR CDR3区的蛋白三维空间结构进行了模拟。结果显示，不同病例之间或同一病例不同增生克隆之间的CDR3区也不具有相同的空间结构。7．为进一步了解慢性乙型肝炎抗病毒治疗后外周血中出现的克隆性增生T细胞的机制，我们采用下列两种方法进行了深入研究。首先依据克隆增生T细胞CDR3区设计了下游特异性引物，并与原BV家族的上游引物配对重新扩增治疗前后同一个BV家族。扩增结果提示，治疗后出现克隆性增生的T细胞与治疗前存在相同长度的CDR3序列；其次对出现单克隆增生的BV家族的治疗前PCR产物进行了克隆测序，结果进一步证实治疗前这些家族为多克隆性，且测得的克隆中，其中一个克隆与治疗后增生的T细胞克隆享有完全相同的CDR3长度和序列。结论1．通过TCR CDR3谱型扫描分析，了解到慢性无症状HBV携带者外周血TCR CDR3谱型存在明显受限，提示细胞免疫参与了其病变过程。另外ELISPOT检测结果提示慢性无症状HBV携带者HBcAg特异的rIFN分泌细胞数量与正常对照无差别(P＞0.05)。这些结果进一步提示克隆性增生的T细胞可能与慢性无症状HBV携带者免疫耐受形成有关。TCR CDR3区序列测定显示克隆性增生的T细胞CDR3区不具有相同的氨基酸序列，提示T细胞的克隆性增生可能并非由单一HBV表位引起。其原因可能与下列因素有关：不同病例之间HLA基因型有别；HBV抗原表位多样性及HBV存在变异。2．慢性乙型肝炎炎症活动期患者的T细胞谱型分析同样证实其外周血TCR CDR3谱型发生了偏移，且所观察到的每个病例均有BV家族呈现单／寡克隆性增生。ELISPOT检测结果提示慢性乙型肝炎HBcAg特异的rIFN分泌细胞数量与正常对照及无症状病毒携带者相比明显较高(P＜0.05)，提示CHB患者炎症活动期克隆性增生T细胞可能以CTL为主及T细胞免疫在肝脏炎症病理中发挥着重要作用。克隆增生的T细胞TCR CDR3序列测定提示增生的T细胞不具有均一性，进一步提示CHB患者炎症活动期T细胞免疫应答是多克隆性的。这与慢性乙型肝炎非活动期T细胞免疫识别较单一抗原表位存在较大差别。进一步CDR3序列分析可以看出，虽然一些增生的T细胞克隆不享有相同CDR3序列，但却含有某些共同的基序，这一结果提示这些T细胞有可能识别HBV抗原肽的相同区域，但是因为HBV变异的出现，可导致它们之间又有差别。TCRβ链可变区三维空间结构模拟结果显示克隆性增生的T细胞TCR CDR3区虽然结构有相似性，但并未发现完全相同的CDR3构型，这一结果也进一步证实CHB患者炎症活动期T细胞免疫应答是多克隆性、多特异性的。3．通过对慢性乙型肝炎拉米夫定(Lamivudine)抗病毒治疗前后TCR CDR3谱型分析，我们可以得出如下结论：①在拉米夫定抗病毒治疗后，患者外周血总的TCR CDR3谱型偏移率改变不大，可能与抗病毒治疗后病毒抗原消失时间较短，或一些抗原在短时间内未完全消失有关。②在拉米夫定抗病毒治疗后，部分TCR BV家族CDR3谱型发生了较明显的改变：一部分BV家族原来的受限谱型恢复至正态分布；一些BV家族由原来的正态谱型转变为单／寡克隆性增生或明显受限谱型。这一结果提示随着抗病毒治疗取得良好应答，细胞免疫应答也发生了较大的变化，原来活化的T细胞克隆随病毒抗原表位消失而失去刺激，最后自行消失。另一方面高载量病毒或高浓度的病毒抗原诱导的部分特异性T细胞克隆耗竭可能随着抗病毒治疗取得良好应答，病毒抗原的下降，使得T细胞克隆重新得以活化。这些克隆增生的T细胞可能与慢性乙型肝炎抗病毒治疗的应答存在着关系。③治疗前后TCR CDR3谱型的变化在一定程度上提示：TCR CDR3免疫扫描分析找到的克隆增生的T淋巴细胞可能是HBV抗原特异性的，进一步说明免疫谱型分析技术是评价抗原选择性克隆增生的有效方法之一。④TCR CDR3序列分析及TCR可变区三维结构模拟进一步证实治疗前后克隆性增生的T细胞并非由同一抗原表位引起的，进一步提示抗病毒治疗细胞免疫发生的变化。总之这一结果对我们制订慢性乙型肝炎抗病毒策略可能会有所启示。4．通过PCR及克隆测序证实CHB抗病毒治疗后外周血出现的T细胞克隆性增生其机制为抗原选择下的优势利用而非外周重排。5．研究结果也提示TCR CDR3免疫谱型分析技术是一种适合临床用来评价T细胞免疫的敏感方法。因其不需要体外扩增T细胞，避免了体外评估中出现的偏差。同时由于谱型分析技术可全面了解T细胞库构成信息，故适合指导临床免疫治疗或评价免疫疗效。此外谱型分析技术可在复杂的T细胞群中寻找出抗原选择的克隆性增生T细胞，然后经CDR3区序列分析及TCR CDR3三维结构模拟，结合利用四聚体技术，有可能引导我们更准确地发现新的HBV表位。