论文部分内容阅读
目的1、设计并合成含有RGD序列的小肽ERC(N~5)2、分析ERC(N~5)与人肝癌细胞系HepG2结合的情况3、观察ERC(N~5)对HepG2细胞增殖、侵袭作用的影响方法1、ERC(N~5)小肽的设计与合成将蛇毒锯鳞蝰素（Echistatin，Ech）氨基酸序列中的RGD模体与C末端序列结合，设计成含16个氨基酸的小肽，其序列为ARGDNMPRNPHKGPAT，命名为ERC(N~5)，由西安联美生物科技有限公司合成。2、ERC(N~5)与人肝癌细胞系HepG2结合情况的分析利用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测人肝癌HepG2细胞、宫颈癌Hela细胞及大肠癌SW620细胞表面αvβ3的表达情况；同时分析多聚甲醛固定处理前后以及胰蛋白酶和EDTA两种消化方式对HepG2细胞表面αvβ3含量的影响；分别将ERC(N~5)和Ech与FITC-LM609（整合素αvβ3的单克隆抗体）和HepG2细胞共同孵育后，流式细胞术检测平均荧光强度和阳性细胞率，分析ERC(N~5)/Ech与抗体竞争结合αvβ3的情况。3、ERC(N~5)对HepG2细胞增殖、侵袭作用的研究采用CCK-8法绘制细胞生长曲线，分析在不同浓度和不同时间条件下，ERC(N~5)对HepG2细胞增殖的影响；采用Annexin V-FITC/PI双染法结合流式细胞仪检测ERC(N~5)对HepG2凋亡的影响，利用光镜观察细胞凋亡形态的变化；采用CCK-8法分析ERC(N~5)对HepG2细胞与胞外基质粘附的影响；利用细胞划痕愈合实验、Transwell迁移实验和Matrigel侵袭实验观察ERC(N~5)对HepG2迁移、侵袭能力的影响。结果1、质谱分析ERC(N~5)氨基酸序列正确，HPLC色谱分析合成产物的纯度为95%。2、肝癌HepG2细胞表面整合素αvβ3表达量为47%，宫颈癌Hela细胞αvβ3的表达量为35.4%，大肠癌SW620细胞αvβ3的表达量为5.8%。3、多聚甲醛固定处理HepG2细胞后，平均荧光强度和阳性细胞率分别为2.23和4.6%，多聚甲醛未处理组分别为6.97和30.1%。同时，利用0.25%胰蛋白酶和1%EDTA消化HepG2细胞后，αvβ3的含量分别为3.6%和47%。4、FITC-LM609与HepG2细胞孵育后，阳性细胞率为57.6%，ERC(N~5)、FITC-LM609与HepG2细胞共孵育后，阳性细胞率随着ERC(N~5)浓度的增大而逐渐减小。终浓度为64μM的ERC(N~5)与Ech孵育细胞后，其阳性细胞率分别为0.3%和30.1%。5、CCK-8实验结果显示，细胞OD值随着ERC(N~5)浓度的增加而逐渐减小；在ERC(N~5)浓度为16μM时，随着培养时间的延长，两组细胞OD值逐渐增大，但是ERC(N~5)处理组OD值明显小于对照组细胞OD值。6、流式细胞术结果显示，ERC(N~5)作用HepG2细胞后，凋亡率提高一倍。7、Fibronectin粘附实验结果显示，在ERC(N~5)作用下，HepG2与Fibronectin的粘附率下降了46.2%。8、ERC(N~5)作用下，HepG2细胞的迁移和侵袭能力分别降低76.4%和79.2%；细胞划痕愈合实验表明，细胞培养24小时后，阴性对照组细胞划痕已经基本愈合，ERC(N~5)处理组划痕依然清晰。结论：1、人肝癌HepG2细胞表面表达整合素αvβ3，ERC(N~5)能够与LM609竞争结合整合素αvβ3从而与HepG2结合。2、ERC(N~5)能够促进HepG2凋亡，从而抑制HepG2的增殖，也能抑制HepG2细胞与胞外基质的粘附及其侵袭迁移能力。