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漆酶是一种含铜多酚氧化酶,它通过降解木质素为食用菌的生长提供充足的碳源,同时还具有促进呼吸作用、提高子实体品质及抑制杂菌生长等功能,是食用菌生长发育及形态建成中不可缺少的酶。目前对于漆酶的研究多集中于酶学性质及工业应用方面,而对于漆酶基因功能没有较为深入的研究。本研究运用原生质体单核化获得单核菌株,利用PCR方法获得松杉灵芝漆酶基因5’端和3’端非编码序列,Split Marker法构建了漆酶基因敲除盒在不同程度敲除漆酶基因,原生质体转化获得敲除菌株。通过测定敲除菌株及出发菌株生理生化指标及出菇实验,探索漆酶基因在松杉灵芝菌丝生长及形态建成中功能,主要研究结果如下:1松杉灵芝单核化及不亲和性因子测定通过原生质体单核化,获得了 17株松杉灵芝单核菌株,单核化率为19.50%。测定其不亲和性因子,6株单核菌株有4种交配型:A1交配型为A1Bα1-β1;A5、A7 交配型为 A2Bα2-β2;A8 交配型为 A2Bα1-β2;A9、A15 交配型为 A1Bα2-β2。2漆酶基因敲除供试菌株筛选及潮霉素抗性检测单核菌株和双核菌株漆酶酶活测定结果表明,A1、A9、A19漆酶酶活最高,分别为91.0U/L、76.3U/L、64.5U/L,结合生长速度和出菇实验结果,选定A1、A9和A19作为漆酶基因敲除供试菌株。对A1、A9和A19潮霉素抗性检测结果表明,当潮霉素浓度达到2000μg/mL时,A1、A9和A19生长可以被抑制。将质粒pCB1003导入A1和A19,获得大量拟转化子,通过PCR检测,得到A163和A1947两个转化子,证明潮霉素抗性基因在松杉灵芝中可以表达。3漆酶基因的敲除及转化子的鉴定利用SEFA-PCR技术扩增出漆酶基因1541bp的5’端非编码序列,利用改良的TAIL-PCR技术扩增出漆酶基因900bp的3’端非编码序列。采用Split Maeker法构建了漆酶基因完全敲除盒L1HL-L3HR及漆酶基因部分敲除盒L3HL-L3HR。利用PEG介导对A1和A9进行转化,对转化子进行PCR鉴定,得到单核敲除菌株△Lac3-A1、△Lac3-A9、△Lac-A9,再利用其获得了双核敲除菌株△Lac3-A19和 △Lac-A19。4漆酶基因在松杉灵芝形态建成中功能的验证菌丝生长速度和漆酶酶活测定结果显示,敲除菌株菌丝生长速度明显减慢,漆酶酶活明显降低;扫描电镜结果显示敲除菌株菌丝干扁且纤细,表面粗糙且分支多;敲除菌株菌落四周呈锯齿状,菌丝紧贴培养基且不易分离;出菇实验显示敲除菌株需要9-10 d形成原基,子实体色浅、无光泽且矮小。计算各菌株生物学效率,出发菌株A1、A9和A19分别为11.37%、12.11%和17.98%,敲除菌株△Lac3-A1、△Lac3-A9、ALac-A9、ALac3-A19 和 △Lac-A19 分别为 2.18%、4.87%、4.86%、2.77%和3.96%,远低于出发菌株。结果表明漆酶基因部分敲除和完全敲除效果基本相同,漆酶影响松杉灵芝菌丝和子实体的生长发育及形态建成。