中国樱桃PpcERF基因克隆与功能研究

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ERF类转录因子是AP2/EREBP超家族重要成员之一,在植物体内起着激活或抑制基因表达的功能。该类转录因子氨基酸序列中含有一个高度保守的60个左右氨基酸组成的AP2结合域。ERF类转录因子广泛参与植物生长发育,且常作用于调节多种功能基因的表达,参与植物抗逆胁迫应答,进而提高植物抗逆能力。  本研究从中国樱桃(Prunus pseudocerasus)转录组文库中获得了一个ERF类转录因子编码基因,命名为PpcERF,克隆分析PpcERF基因的序列结构,利用实时荧光定量PCR技术及遗传转化手段分析PpcERF基因的表达和功能特性,并取得以下主要研究结果:  1.克隆获得的PpcERF基因开放阅读框长度为1059 bp,编码352个氨基酸残基,分子量约为39 kD。含有单一、保守的AP2/ERF结构域。疏水性/亲水性分析表明PpcERF为亲水性蛋白。PpcERF氨基酸序列与李属植物氨基酸序列的相似度较高。聚类分析发现该基因与碧桃ERF基因具有较近亲缘关系。在拟南芥基因数据库中比对后发现与ERF5/6相似性较高,推测PpcERF基因与拟南芥ERF5/6基因具有相似功能。  2.为了能够利用Real-time PCR技术准确分析PpcERF基因的表达模式,本研究直先对18S rRNA、ACTB、TUB、UBCE、TIF5A、EF1B和GAPDH7个看家基因的稳定性进行了分析。通过实时荧光定量PCR扩增,利用Genorm、Bestkeeper、NormFinder、△Ct以及在线评估程序确定了4℃和NaCl处理下较可靠的内参基因是GAPDH,在ABA处理下和花芽休眠解除过程中较合适的内参基因分别是ACTB和UBCE。  3.利用Real-time PCR技术对PpcERF基因在不同处理条件下的表达特性进行分析。结果表明,在H2O2和PEG2000处理下,PpcERF基因的表达量呈先上升后下降趋势;在4℃处理抑制PpcERF基因表达;在低温诱导樱桃花芽休眠解除过程中,低温积累达到236 C.U时,表达量达到最高,随后下降;在ABA和NaCl处理下,PpcERF基因的表达量变化不明显。因此认为PpcERF基因可能参与氧化胁迫、干旱胁迫以及低温胁迫响应。  4.为更加深入研究PpcERF基因的功能,本研究构建了植物表达载体,由35S启动子驱动该基因表达。利用蘸花法获得了转基因拟南芥株系。超量表达PpcERF基因拟南芥植株整体偏小,叶片卷曲其较薄。使用不同浓度H2O2对拟南芥种子进行处理,发现转基因拟南芥种子在含有4mmol/LH2O2培养基中的萌发势和萌发率较高。在对下游基因定量分析发现,转基因拟南芥中GA2-OX6基因和RX33基因表达水平高于野生型。推测PpcERF基因可能通过调控GA的活性,影响叶片的正常生长,同时可能通过调控抗氧化基因表达提高了种子的抗氧化能力。  通过以上研究结果,明确了PpcERF基因的结构特征、表达特性及功能,为植物抗逆研究提供理论支持。
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