研究目的通过对大鼠血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)体外不同条件的培养,检测其细胞增殖、表型基因SM22α和骨架蛋白表达的变化,探讨细胞表型转化、增殖与细胞骨架蛋白变化之间的关系,为研究VSMC细胞骨架重构在相关疾病中的作用提供新依据。实验方法实验分组体外贴壁法培养大鼠腹主动脉VSMCs,实验分别取2代(p2),4代(p4),6代(p6)细胞。每代细胞贴壁后用0.5%NSC DMEM培养液同步化处理24h后,试验分组:血清组:同步化后细胞用12%NSC的DMEM培养72h,收集细胞;血清饥饿组:同步化后细胞用12% NSC的DMEM培养72h,细胞处在合成期,再血清饥饿48h,收集细胞。各组细胞用考马斯亮蓝观察细胞形态结构,用电镜观察细胞的超微结构,用荧光免疫组织化学染色观察细胞骨架,用5-BrDU标记细胞增殖情况,用RT-PCR检测VSMC表型标志基因SM22α的表达。每代细胞做同样的试验。5-BrDU免疫组织化学染色每组各取3张圆玻片做免疫组织化学,具体步骤如下:将细胞载玻片用0.01%PBS冲洗后,用含0.3%双氧水的甲醇封闭40 min;2N盐酸37℃1h;正常养血清封闭20min,以上各步之间用0.01%PBS冲洗3次。5-BrDU抗体(1:300)4℃过夜;二抗(1:50)37℃30min;SABC 37℃20min;DAB显色3min,以上各步之间用0.01%PBS冲洗3次。脱水,二甲苯透明,封片显微镜下观察。每张切片都进行阳性细胞计数,每组阳性标记细胞以X±s表示,用t检验有显著性差异。荧光免疫组织化学染色每组各取3张细胞载玻片做免疫组织化学,步骤如下:将细胞载玻片用0.01%PBS冲洗后,用0.3% Triton-100封闭30min;正常养血清封闭40min;一抗体(1:400)4℃过夜;二抗(1:500)37℃60min;液体石蜡油封片,荧光显微镜下观察,并进行光密度分析,每组以平均光密度置分析,用t检验有显著性差异。RT-PCR检测将上述试验收集的细胞用一步法(Trizol试剂)提取总RNA,在20ul反应体系中42℃50 min,70℃15min,逆转录mRNA为cDNA。取逆转录产物3ul加入聚合酶连反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)体系,在50ul反应体系中进行聚合酶链反应。聚合酶链反应:94℃变性50s,57℃退火50s,72℃延伸1min,共35个循环。产物经图像处理系统进行分析,同一试验重复3次。电镜将细胞按电镜方法包埋和切片,在透视电镜下观察。结果一、VSMC增殖的变化免疫组织化学染色显示:随培养代数增加,标记的增殖细胞越多,第6代标记的增殖细胞最多。血清饥饿组较血清培养组的VSMC标记的增殖细胞明显减少。二、表型基因SM22a表达变化RT-PCR结果表明,在体外培养的VSMC低代数(p2)细胞血清培养时SM22α基因有微量表达,随着代数的增加SM22a的mRNA的表达水平逐渐降低,至第6代(P6)几乎不表达。这表明在体外培养的VSMC随代数的增多,细胞的表型也逐渐有收缩型变为合成型。血清饥饿后,SM22a的mRNA水平迅速上升,但随培养代数的增加该基因表达水平逐渐降低。血清因素对细胞表型转化起重要作用;血清饥饿能逆转细胞表型,但随培养代数的增加这种逆转细胞表型转化的作用逐渐降低。三、细胞骨架蛋白表达的变化荧光免疫组织化学染色显示,血清培养条件下SMα-actin随培养代数的增加其表达减少,血清饥饿培养SMα-actin表达上调。但随培养代数的增加,其表达减少,至第6代仅有少量细胞表达。血清培养条件下随培养代数的增加β-Tubulin和Desmin表达减少,血清饥饿后上调也不明显,至第6代基本不表达。血清饥饿后细胞骨架蛋白表达增多,但在高代数时血清饥饿不能逆转β–Tubulin和Desmin的重新表达。四、超微结构的变化电镜下观察到血清培养组胞浆中的内质网、线粒体和高尔基体等细胞器增多,有大量的分泌小泡;血清饥饿组胞浆中内质网、线粒体和高尔基体等细胞器明显减少。随培养代数的增加,第8代与第3代相比,胞浆内线粒体、内质网和分泌小泡均增多,呈明显的合成型特征。结论1.血清培养随细胞代数的增多,细胞表型标志基因SM22a及细胞骨架蛋白SM-a-actin、β-Tubulin和Desmin表达逐渐减少、细胞增殖能力增强,至第6代SM22a、β-Tubulin和Desmin表达消失。2.血清饥饿培养能逆转细胞表型基因SM22a及细胞骨架蛋白SM-a-actin、β-Tublin和Desmin表达,但至第6代不能逆转β-Tubulin和Desmin的表达。3.β-Tubulin和Desmin在传代培养第6代表达消失,并血清饥饿培养也不能逆转。提示:β-Tubulin和Desmin可作为分泌型病理性增殖VSMC的的鉴定标志。4.VSMC表型、增殖和骨架蛋白表达之间存在内在的联系,它们在维持细胞形态、收缩功能和血管重构方面可能起了重要作用。但它们之间的因果关系有待进一步研究。