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异种体细胞核移植研究可以揭示不同动物之间细胞核质互作的特征和规律,在实践上可以使珍稀濒危动物的快速繁育变得可行。本研究利用体细胞核移植技术路线,对水牛—牛异种体细胞核移植进行了初步探索。重点从受体卵母细胞胞质成熟时间、激活方法、供体细胞处理、胚胎培养系统等几个方面做了研究,建立了本实验的体细胞核移植技术平台;通过该平台对水牛—牛异种体细胞核移植胚胎发育的可能性进行了探索性研究;并对水牛—牛异种体细胞核移植早期胚胎发育效率与水牛、牛同种体细胞核移植进行了比较。 1、体细胞核移植技术平台建立 1)首先,本试验利用牛卵母细胞孤雌激活的方法,比较了几种不同的化学激活方法,发现联合激活方法比单一化学试剂激活方法效率高,而在联合激活的方法中,Ionomycin+6-DMAP激活效率最好,其激活后8-细胞~桑椹胚发育率明显高于EH+6-DMAP(22.0% vs.15.2%,p<0.05)与A23187+6-DMAP(22.0% vs.9.8%,p<0.05)。 2)其次,比较了M199培养液和CR1aa培养液对牛孤雌胚的培养效果,结果表明CR1aa培养液比M199培养液更适合牛胚胎的培养(21.7% vs.16.7%,P<0.05)。 3)比较牛卵母细胞不同成熟时间对成熟率和去核率的影响,结果表明,牛卵母细胞体外培养16~18h组的成熟率显著低于体外培养19~21h(45.6% vs.60.8%,p<0.05)和22~24h(45.6%vs.64.7%,p<0.05)组。而卵母细胞体外培养22~24h组的去核率显著低于体外培养16~18h(52.2% vs.80.6%,p<0.05)与19~21h(52.2% vs.73.3%,p<0.05)组。为了提高盲吸法核移植效率,本试验选择成熟培养20h的牛卵母细胞作为核受体。 4)然后,在供体细胞的处理上,本试验以水牛颗粒细胞作为供体细胞,一部分长满后进行核移植试验,一部分饥饿处理后进行核移植试验,结果发现单独血清饥饿处理供体细胞对核移植效果没有显著影响(9.5% vs.11.5%,p>0.05)。 2、水牛颗粒细胞核移入牛去核卵母细胞质的研究 在建立了体细胞核移植技术基本平台的基础上,以水牛颗粒细胞作为供核体,牛去核成熟卵母细胞作为受体,通过胞质内直接注射方法进行异种体细胞核移植,重构胚能够发育到