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背景与目的:乳腺癌是威胁女性健康的常见肿瘤之一,欧美国家高发,亚洲发病率虽低但却逐年上升。尽管现在我们可以运用化疗、放疗、内分泌治疗、靶向治疗、免疫治疗等手段治疗乳腺癌,但多线治疗失败后,乳腺癌患者仍面临着多药耐药的窘境。YB-1是一个转录和翻译因子,被认为是多种实体瘤的癌基因,通过与RNA结合,参与mRNA剪切、转录、翻译、细胞增殖、凋亡和耐药等过程,与患者的预后及耐药存在一定的关系。乳腺癌耐药蛋白(Breast Cancer Drug Resisitance Protein,BCRP)是ABC半转运蛋白,最初从乳腺癌耐药细胞株中克隆出来,参与抗肿瘤药物的外排,致使肿瘤细胞耐药。本研究旨在探讨YB-1表达水平与临床特征、病理参数的相关性;观察YB-1表达水平对乳腺癌细胞生长、增殖、迁移和侵袭的影响;了解YB-1表达水平对阿霉素处理后乳腺癌耐药细胞化疗疗效的影响;分析YB-1与乳腺癌耐药蛋白(BCRP)在耐药机制方面是否存在相关性。通过对以上问题的研究和探讨,进一步明确YB-1对乳腺癌和乳腺癌耐药细胞的影响。第一部分乳腺癌组织YB-1的表达水平与临床特征、病理参数之间的关系目的:对比乳腺癌组织及癌旁组织中YB-1的表达水平,分析乳腺癌组织中YB-1表达水平与临床特征、病理参数之间的关系。方法:收集48例II-III期乳腺浸润性导管癌患者的癌组织和20例乳腺癌患者的癌旁组织,对所有标本进行免疫组化染色,根据染色阳性细胞数目百分比分为0至4分,其中染色阴性为0分,染色阳性细胞数目百分比≤10%为1分,11%-50%为2分,51%-75%为3分,≥75%为4分。对比乳腺癌组织和癌旁组织中YB-1的表达水平,对48例乳腺癌患者的临床特征、病理资料进行查阅核实、统计随访,运用独立样本t检验和one-way ANOVA统计方法研究YB-1表达水平与乳腺癌各项临床特征、病理参数之间的关系。结果:与乳腺癌组织相比,癌旁组织中YB-1的表达明显减少,17例癌旁组织YB-1表达为0-1分,占85%,3例癌旁组织YB-1表达为2分,且均未见核染色(中位分值2.52 vs 1.10,F=12.048,sig=0.001);48例乳腺癌患者中区域淋巴结阳性27例(占65.2%),区域淋巴结阴性21例(占43.8%),根据YB-1免疫组化染色情况,统计各位患者YB-1表达分值,发现YB-1表达水平在区域淋巴结阳性患者中明显高于区域淋巴结阴性者,差异有统计学意义(P=0.017)。年龄≤35岁的乳腺癌患者为11人,其中有7位患者YB-1表达水平分值为3-4分,YB-1高表达的乳腺癌患者有年轻化趋势,但差异无统计学意义。经统计分析提示YB-1表达水平在年龄、肿块大小、组织学分级、分子分型和术后分期方面差异无统计学意义。结论:YB-1高表达的患者易于出现区域淋巴结转移,且呈现低龄趋势。第二部分YB-1表达水平对乳腺癌细胞生长、增殖、迁移、侵袭的影响目的:探讨YB-1表达水平对乳腺癌细胞生长、增殖、迁移、侵袭的影响方法:1、利用MTT法检测不同浓度阿霉素、顺铂和5-FU对乳腺癌细胞MCF-7和乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR增殖的影响,绘制生长曲线,并计算IC50,验证乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR;2、利用慢病毒转染技术,将YB-1过表达载体与干扰载体转染至乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR中,得到稳转株后用Western blot检测YB-1蛋白的表达水平,以明确转染效果,设置MCF-7/ADR为对照组、MCF-7/ADR+YB-1过表达组、MCF-7/ADR+YB-1干扰组、MCF-7/ADR+空载组为实验组。3、运用电子显微镜观察各组细胞的生长情况;利用流式细胞检测技术检测细胞周期蛋白;CCK-8法检测24h、48h、72h三个时间点各组细胞的增殖情况,并绘制增殖曲线;Transwell侵袭实验法检测各组细胞的迁移和侵袭能力。4、运用荧光定量RT-PCR和Western blot检测各实验组细胞YB-1及相应mRNA表达水平。5、选取生长状态良好的乳腺癌细胞MCF-7和乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR接种于裸鼠皮下组织,裸鼠成瘤后,治疗组给予ADM(阿霉素)4mg/kg干预,对照组给予等量生理盐水腹腔注射,依据细胞株和给药情况将裸鼠分为四组,分别是MCF-7组、MCF-7+ADR组、MCF-7/ADR组和MCF-7/ADR+ADR组,在无菌、清洁的环境下饲养14天后取移植瘤组织,测量移植瘤重和瘤体积,观察生长曲线的变化,利用流式细胞技术检测细胞周期蛋白,qRT-PCR和Western blot技术检测YB-1蛋白表达水平。结果:1、裸鼠实验:不论有无经阿霉素处理,乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR移植瘤重和瘤体积均大于MCF-7移植瘤。YB-1、BCRP、Cyclin E、Cyclin D和P53在乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR中的表达水平均高于乳腺癌细胞MCF-7,但GAPDH表达水平在四组细胞中差异无统计学意义。2、细胞实验:YB-1mRNA在MCF-7/ADR耐药细胞株中的表达水平明显增高;CCK-8实验中24h、48h和72h三个时间点各组细胞中MCF-7/ADR+YB-1过表达细胞增殖能力最强,MCF-7/ADR+YB-1干扰细胞增殖能力最弱;YB-1过表达乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR在迁移和侵袭能力增强,而MCF-7/ADR+YB-1干扰细胞迁移和侵袭能力均有所减弱,两组细胞的迁移和侵袭能力差异有统计学意义(P<0.05);细胞周期检测:MCF-7/ADR+YB-1干扰细胞在G1期占65.67%,S期和G2期细胞数相对较少,而MCR-7/ADR空载和MCF-7/ADR+YB-1过表达细胞比例在G1期相对减少,S期相对增多,大约90%左右的细胞停滞在G1/S期。结论:YB-1过表达会促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭,YB-1作用于G1期,促进乳腺癌细胞向S期转化。第三部分乳腺癌耐药细胞中YB-1的表达水平对阿霉素化疗敏感性的影响目的:探讨乳腺癌耐药细胞中YB-1的表达水平对阿霉素化疗敏感性的影响。方法:运用CCK-8试剂盒检测经阿霉素处理后的MCF-7/ADR+空载、MCF-7/ADR+YB-1过表达和MCF-7/ADR+YB-1干扰三组乳腺癌耐药细胞的增殖能力;Transwell检测经阿霉素处理后各组细胞的迁移和侵袭能力;免疫荧光技术检测各组细胞经阿霉素处理前后的变化。结果:YB-1过表达的乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR在接受阿霉素处理后增殖能力虽有所下降,但阿霉素处理前后差异无统计学意义,而YB-1干扰的乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR增殖能力下降最为显著,差异有统计学意义;经阿霉素处理后,YB-1过表达乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR的迁移和侵袭能力并未出现明显的下降,差异无统计学意义(P>0.05)。YB-1干扰的乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR的迁移和侵袭能力都有显著的下降,差异有统计学意义(P<0.05);免疫荧光实验中MCF-7/ADR+YB-1过表达细胞在经过阿霉素处理后YB-1的表达水平未见明显减弱,而MCF-7/ADR+YB-1干扰细胞YB-1表达水平可见明显减少。结论:YB-1过表达降低乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR对阿霉素的化疗敏感性。第四部分BCRP与YB-1的关系目的:探讨BCRP与YB-1在乳腺癌化疗耐药方面是否存在相关性方法:检测BCRP在乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR中的表达水平,运用免疫共沉淀技术,检测BCRP与YB-1在乳腺癌化疗耐药方面是否存在相关性。结果:1、不论有无经阿霉素处理,BCRP在乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR中表达水平增高。2、免疫共沉淀实验:在YB-1过表达的乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR中,YB-1和BCRP的表达明显增强,而MCF-7/ADR+YB-1干扰细胞中,YB-1和BCRP的表达明显减弱,空载细胞中YB-1和BCRP的表达位于两者之间,在经阿霉素处理的细胞中,YB-1和BCRP表达水平亦是如此。结论:在乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR中BCRP表达水平增高,在YB-1过表达、YB-1干扰及空载细胞组,YB-1和BCRP的表达存在同步现象。因此,YB-1和BCRP的表达存在一定的相关性,但机制未明。