背景结肠癌为一种消化道肿瘤疾病,是除了肺癌和乳腺癌外的另一种高发性的肿瘤疾病。在各种肿瘤疾病中结肠癌的致死率居于第二位。结肠癌的发生有多种因素:如环境、饮食和遗传等;也有生物体自身的因素,如原癌基因的激活或抑癌基因的抑制。由结肠癌的发病多因素可见其发病机制相当复杂,因此,了解原癌基因或抑癌基因在结肠癌发生和发展中的作用机制对结肠癌的治疗有很大的帮助。PTBP1作为非单一核糖核蛋白家族中的一员,通过四个不同的结合区域与RNA相结合,改变RNA的结构和调控RNA的可变剪切。PTBP1是一种可以在细胞核与细胞质之间穿梭的蛋白,在一定条件下如细胞受到外界环境压力:病毒感染,有毒物质暴露时PTBP1蛋白由胞核穿梭出到细胞质。在细胞核中PTBP1行使调控可变剪切的功能,与UTRS相结合增强基因的转录;在细胞质中,PTBP1通过与3’UTR结合来增加m RNA的稳定性,调控m RNA的定位和转导。PTBP1以上的功能使其具有调控胰岛β细胞中胰岛素的分泌,细胞周期和凋亡相关蛋白表达,影响细胞的增殖,分裂和分化等重要生命活动。PTBP1与胚胎发育,神经元分化,二型糖尿病和肿瘤的发生都有一定的关系。有研究表明,PTBP1在乳腺癌和卵巢癌中均高表达,且抑制PTBP1在二者中的表达可以明显地降低细胞的增殖能力。但是与此结论相反的是,Lin等研究发现,在非小细胞肺癌细胞H1299和A549中,过表达PTBP1可以降低细胞增殖的能力。以往的研究提示,PTBP1可能参与了人类肿瘤发生,但并不清楚是作为癌基因抑或是抑癌基因来发挥生物学作用的。基于目前还没有研究报道PTBP1在结肠癌当中的功能,并且结肠癌作为一种高发性的肿瘤疾病,有必要对其发病机制进行研究。因此,本论文旨在探究PTBP1在结肠癌发生和发展过程中的生物学功能,以期找出PTBP1在结肠癌发生中的分子作用机制,这将有利于临床上对结肠癌的治疗。第一章PTBP1在结肠癌组织芯片中的表达目的:通过组织芯片检测PTBP1在人类正常结肠组织和癌组织中的表达,分析PTBP1在结肠癌旁组织和结肠癌组织中的表达变化。方法:1.收集90例结肠癌组织标本进行石蜡包埋2.将石蜡包埋组织切片并制作组织芯片3.应用免疫组化技术检测PTBP1在人类结肠组织和癌组织中的表达,并进行分析。结果:PTBP1在结肠癌组织中的表达高于其在结肠癌旁组织中的表达,且其表达与淋巴结转移和临床分期相关。结论:PTBP1在结直肠癌发展过程中表达逐渐升高,提示其与结直肠癌的发展有关,可以作为结肠癌分期的一个生物指标。第二章PTBP1基因对结肠癌细胞生物学行为的影响目的:检测PTBP1在结肠正常和癌变细胞中的表达情况,抑制PTBP1在结肠癌细胞中的表达,观察细胞的形态,生长活力,细胞增殖,周期和凋亡等生物学行为的变化。方法:1.不同结肠细胞中PTBP1表达检测:分别用Q-PCR和Western blot方法检测FHC/HCT116/HCT8/SW480细胞中PTBP1 m RNA和蛋白水平的表达。2.检测沉默PTBP1基因后HCT116和SW480细胞的生长活力:用PTBP1 si RNA转染HCT116细胞。转染48h后,用倒置显微镜(10×)观察细胞形态,每个样品随机选取5个视野观察并拍照。用PTBP1 si RNA转染HCT116和SW480细胞。于转染后48h,分别用细胞增殖-毒性检测试剂MTS和Ed U试剂检测细胞活力和细胞增殖能力。3.检测沉默PTBP1基因后HCT116和SW480细胞的周期:用PTBP1 si RNA转染HCT116和SW480细胞,于转染后48h,用细胞周期与凋亡检测试剂盒按照说明书操作处理细胞,流式细胞仪检测两种细胞的周期变化。4.检测沉默PTBP1基因后的HCT116和SW480细胞凋亡:用PTBP1 si RNA转染HCT116和SW480细胞,于转染后48h,用碧云天Hoechst33258试剂染色在荧光显微镜下观测细胞形态的变化;用Annexing-FITC双染试剂处理细胞后经流式细胞仪检测细胞凋亡变化。5.检测沉默PTBP1基因后HCT116细胞对5-FU,顺铂和多柔比星的敏感性:用PTBP1 si RNA转染HCT116细胞,于转染后48h,分别加不同浓度的5-FU,顺铂和多柔比星处理细胞48h,最后用MTS检测生长活性。结果:1.结肠癌细胞HCT116/SW480/HCT8中PTBP1 m RNA和蛋白的表达量均高于正常结肠细胞FHC,且在HCT116细胞中的表达量最高。2.用PTBP1 si RNA干扰HCT116和SW480细胞中PTBP1的表达后,HCT116和SW480细胞的活力降低,细胞增殖能力降低,细胞生长被抑制。3.用PTBP1 si RNA干扰HCT116和SW480细胞中PTBP1的表达后,与对照组相比,PTBP1 si RNA组的HCT116和SW480细胞周期被阻滞于S期。4.用PTBP1 si RNA干扰HCT116和SW480细胞中PTBP1的表达。与对照组相比,PTBP1 si RNA组的HCT116和SW480细胞发生明显的细胞凋亡。5.用PTBP1 si RNA干扰HCT116的表达后,与对照组相比,PTBP1 si RNA组的HCT116细胞对5-FU,顺铂和多柔比星的敏感性增加。结论:PTBP1可调控肿瘤细胞的生长,抑制PTBP1表达,可降低肿瘤细胞的生长,其原因在于PTBP1低表达后,可导致细胞增殖能力降低、细胞周期阻滞、细胞凋亡增加,因此在结直肠癌的发生过程中,PTBP1是一个典型的癌基因。第三章PTBP1在结肠癌细胞中生物学功能的分子机制研究目的:探讨PTBP1调控HCT116细胞增殖、周期和凋亡的分子机制。方法:1.PTBP1 si RNA干扰HCT116细胞中PTBP1的表达,用Western blot法检测细胞增殖相关蛋白p-AKT、AKT和p85的变化。2.PTBP1 si RNA干扰HCT116细胞中PTBP1的表达,用Western blot法检测细胞周期相关蛋白CDK4和cyclin D1的变化。3.PTBP1 si RNA干扰HCT116细胞中PTBP1的表达,用Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白p53、cyto C、Bcl-2、Bax、Caspase3和PARP1的变化。结果:1.与对照组相比,沉默PTBP1基因后,p-AKT和p85表达减少。2.与对照组相比,沉默PTBP1基因后,cyclin D1表达明显下调。3.与对照组相比,沉默PTBP1基因后,p53和cyto C表达增加;抑制凋亡发生的Bcl-2的表达减少,促进凋亡发生的Bax表达增加;Caspase3和PARP1活化增加。结论:抑制PTBP1后可通过下调增殖相关蛋白p-AKT、p85,周期相关蛋白cyclin D1等表达抑制细胞生长;另一方面,增加凋亡相关蛋白cyto C、p53和Bax的表达,和下调Bcl-2的表达以及活化Caspase3和PARP1来诱导细胞凋亡。