第一部分：结合激光微切割与cDNA芯片筛选胃癌淋巴结转移相关基因 目的：建立激光微切割的标准操作规程，并在严格的实验控制下，获取胃癌原发灶及转移灶肿瘤细胞，进行基因表达谱比较。 方法：取2例胃管状腺癌的原发灶及淋巴结转移灶，经冰冻切片、TBO染色后，用LMD获取病灶中的肿瘤细胞，在每一关键步骤均设立质控标本，其ttRNA经线性扩增后，采用cDNA芯片技术，比较两种肿瘤细胞间的基因表达差异，筛选出的差异表达基因用半定量RT-PCR验证。 结果：通过LMD，成功获取手术标本中的目的细胞，而且其ttRNA经多种方法检测均无明显降解；微量的。ttRNA经线性扩增后，利用基因芯片筛选出49个基因的表达在胃癌原发灶肿瘤细胞中比淋巴结转移灶明显上调，37个基因的表达明显下调；结果经半定量RT-PCR验证，与芯片结果一致。 结论：用LMD获得的细胞ttRNA可成功用于基因芯片杂交，线性扩增没有造成样品中基因信息的失真，获得的芯片结果是可信的，为下一步筛选工作奠定了基础。 第二部分：筛选胃癌进展过程中的差异表达基因 目的：进一步验证基因芯片筛选出的差异表达基因，并从中筛选出在胃癌发生和淋巴结转移的进展过程中都呈差异表达的基因。 方法：在第一部分筛选出的46个差异表达的已知基因中，利用生物信息学分析，确定25个为进一步筛选的目的基因；用LMD获取15例胃癌的正常胃上皮细胞、原发灶肿瘤细胞及淋巴结转移灶肿瘤细胞；用半定量RT-PCR比较25 个目的基因在15对胃癌原发灶与淋巴结转移灶肿瘤细胞中的表达丰度；筛选出在大多数病例中（>8／15），半定量RT-PCR结果与芯片结果一致的基因：进一步比较这些基因在15对正常胃上皮与胃癌原发灶肿瘤细胞中的表达丰度；最终筛选出在胃癌发生与淋巴结转移的进展过程中都呈差异表达的基因；并用免疫组织化学染色，在蛋白质水平验证筛选结果。 结果：从25个目的基因中，筛选出12个基因，在大部分标本中（>8／15）的半定量RT-PCR结果与芯片结果是一致的，其中7个为上调基因，5个为下调基因；进一步用半定量PCR了解这12个基因在15对正常胃上皮细胞与胃癌原发灶肿瘤细胞间的表达差异，发现它们在大部分标本中（>8／15）的表达谱可以分为6类，其中1类（OPCML、RNASE1、YES1），还有1类基因的差异表达规律与癌基因相同（ACK1）；OPCML的表达经免疫组化验证，与RT-PCR结果一致。 结论：通过一系列有效的筛选手段，在基因芯片筛选出的胃癌淋巴结转移相关基因中，成功找到4个在胃癌发生和转移过程中都呈差异表达、而且其差异表达的规律符合肿瘤抑制基因或癌基因表达方式的基因。 第三部分：新的肿瘤抑制基因OPCML的功能研究 目的：构建OPCML的真核过表达载体，应用一系列体外及体内实验，研究OPCML表达与胃癌细胞生物学行为间的关系；并初步探讨OPCML在胃癌中表达下调的可能机制。 方法：将OPCML的全长ORF序列连接到真核细胞过表达载体pcDNA3.1（+）中，用构建好的载体转染不表达OPCML的胃癌细胞株，以转染空载质粒的细胞株为对照，通过细胞体外增殖试验（MTT）、软琼脂集落形成试验、体外Transwell迁移实验及裸鼠体内成瘤实验，了解OPCML表达对胃癌细胞增殖、成瘤及迁移 的影响；并用AZA处理体外培养的胃癌细胞株，观察处理前后细胞株中OPCML的表达变化。 结果：应用基因重组技术，成功构建pcDNA3.1（+）/OPCML过表达载体；利用过表达OPCML的胃癌细胞株，发现OPCML可以极为显著地抑制胃癌细胞的体外增殖能力（MTT实验）和成瘤能力（软琼脂克隆形成实验），同时也能显著降低胃癌细胞的体外迁移能力（Transwell实验）和体内成瘤能力；胃癌细胞株经AZA处理后，OPCML的表达明显上调。 结论：OPCML是一个新的肿瘤抑制基因，对胃癌细胞的增殖、成瘤及迁移能力有显著的抑制作用；OPCML在胃癌中的表达下调可能与其启动子甲基化有关。