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西兰花(Brassica oleracea L.var.italic)富含类黄酮化合物、抗坏血酸(V_C)、硫代葡萄糖苷、萝卜硫素等多种营养成分和生物活性物质,深受消费者喜爱,近年来,其栽培面积不断扩大。然而,西兰花不耐贮运,采收后花球极易褪绿转黄,并伴随着营养成分的变化,严重影响西兰花的商品品质和价值,因此,研究褪绿机理,探索调控技术具有重要的理论和实践意义。本文以“耐寒优秀”品种的西兰花为试材,首先分析了西兰花在不同温度条件下的黄化规律;然后通过转录组测序技术从整体转录水平研究西兰花转黄过程中基因的差异表达,分析差异表达基因(DEGs)的功能及其参与的代谢途径。在此基础上进一步筛选西兰花转黄过程中色素物质代谢的关键酶基因,研究转录因子对黄化关键酶基因的转录调控模式,从分子水平揭示西兰花采后黄化的机理。基于上述机理研究结果进一步探寻了相应的调控技术。主要研究结果如下:(1)在本试验设置的温度下(20℃、10℃和0℃),温度越高,西兰花转黄发生越早,程度越严重。黄化过程中西兰花a*值和b*值增加,h°值降低,花蕾形态未发生明显改变,花蕾也无开花迹象,黄化从花蕾基部向顶部蔓延,伴随这一过程,花蕾细胞表面组织损坏,叶绿体发育异常并向有色体转变。花蕾中总叶绿素含量降低,叶绿素a含量减少,叶绿素b含量波动降低,类胡萝卜素组分含量增加。相关分析结果表明,叶绿素b,β-隐黄质和β-胡萝卜素是西兰花黄化的重要色素成分。(2)西兰花在10℃下贮藏第5 d开始转黄,12 d重度黄化。分别在0 d、5 d和12 d取样,进行转录组测序分析,筛选出1717个DEGs,并富集到92条代谢通路中。分别从叶绿素代谢,类胡萝卜素生物合成和类黄酮生物合成代谢通路上筛选出6种、5种和4种DEGs。差异表达的转录因子共有579个。GO分析表明,多种MYB、bHLH和bZip转录因子家族成员富集在叶绿素代谢通路上;富集在类胡萝卜素生物合成通路的转录因子家族是NAC和乙烯反应因子(ERF);类黄酮生物合成途径受MYB,NAC,WRKY,MADS和bZip转录因子家族的调控。BobHLH66,BoPIF4,BoLOB13,BoNAC92和BoAPL转录因子是色素代谢途径中潜在的调节因子。在黄化的过程中,Fv/Fm值和叶绿素含量下降,非光化学猝灭(NPQ)水平和类胡萝卜素含量增加。(3)从西兰花中成功克隆出BoCAO和BoHYD基因的启动子序列以及BoPIF4和BobHLH66基因的全长编码区序列。BoPIF4和BobHLH66为核定位蛋白,并鉴定为bHLH转录因子家族成员。BoPIF4和BobHLH66转录因子分别通过与G-box和GCACGTGC元件特异性结合叶绿素降解关键酶基因BoCAO和类胡萝卜素生物合成关键酶基因BoHYD,并正向激活BoCAO和BoHYD的转录。其中,BoPIF4的转录激活能力显著高于BobHLH66。(4)BoPIF4和BobHLH66同源基因(AtPIF4和AtbHLH66)的编码区全长片段从拟南芥中被克隆出。成功将目的基因片段(AtPIF4和AtbHLH66)重组到过表达和基因干扰(RNAi)载体中。AtPIF4和AtbHLH66基因过表达显著提升AtCAO和AtHYD基因的转录水平,并诱导拟南芥中叶绿素含量降低和类胡萝卜素含量积累,加剧叶绿体的异常发育,从而促进拟南芥叶片的黄化。相反,RNAi株系中AtCAO和AtHYD转录水平降低,在保护叶绿素降解、抑制类胡萝卜素合成以及维持叶绿体结构方面的作用显著,使得RNAi转基因植株呈现绿色表型。(5)20℃条件下,经褪黑素处理的西兰花转黄表型出现较比对照组延迟4 d。褪黑素处理通过抑制黄化关键基因(BoCAO和BoHYD)与转录因子编码基因(BoPIF4和BobHLH66)的转录水平,抑制花球中叶绿素的降解与类胡萝卜素的积累,进而延缓西兰花花球转黄。同时,该处理有效提高自由基清除能力以及类黄酮和V_C含量。