胰腺癌是我国乃至全世界范围内最为恶性和致命的癌症之一,死亡率与发病率之比接近1.0,5年生存率极低。胰腺癌往往起病隐匿,缺乏早期症状,多数病例诊断之时已经是中晚期,没有手术治疗指征。药物治疗是胰腺癌患者治疗的重要选择。目前,由奥沙利铂、伊立替康、氟尿嘧啶和亚叶酸钙组成的联合用药方案FOLFIRINOX是晚期胰腺癌药物治疗的一线化疗方案。研究表明,接受吉西他滨单药治疗的胰腺癌患者中位生存时间只有6.8个月,而FOLFIRINOX化疗方案可以提高胰腺癌患者中位生存时间至11.1个月,仍伴随严重的化疗副作用。此外,胰腺癌对现有其他化疗及放疗方案也表现出高度抵抗性,也是目前胰腺癌患者总体转归不良的主要原因。研发新型抗肿瘤药物可以改善胰腺癌患者疗效并减少药物副作用,是目前胰腺癌研究领域的热点。纳米药物是胰腺癌新型药物研发的热点,借由肿瘤组织血管内皮细胞间隙增大、缺乏回流等机制介导的增强渗透滞留效应,实现纳米药物进入体循环后在肿瘤组织中的靶向富集,通过穿透、内吞、释放等步骤杀死肿瘤细胞。伊立替康脂质体（ONIVYDE）是2015年美国FDA批准用于治疗胰腺癌临床患者的一种纳米药物,由脂质体搭载小分子伊立替康（CPT-11）组装形成。与单纯CPT-11相比,ONIVYDE实现向胰腺癌组织高效运输CPT-11的目的,但其对胰腺癌的治疗效果总体提升有限。原因在于,CPT-11是7-乙基-10-羟基喜树碱（SN-38）的前药,必须通过羧酸酯酶介导的催化作用将其水解为活性形式SN-38,才能发挥抗肿瘤活性,而羧酸酯酶在人体胰腺及肿瘤组织中表达较低,导致CPT-11虽能有效富集于肿瘤组织但向活性SN-38转化不足。通过构建纳米药物直接搭载活性SN-38以减少对羧酸酯酶催化的依赖是提高SN-38相关纳米药物抗肿瘤活性的有效手段。SN-38具有很强的疏水性及易析出性,无法直接用于临床。另外,常规载体（如:脂质体,聚合物胶束）搭载SN-38形成的纳米药物因为载体的临床准入性,在远期临床转化之前往往需要更加广泛的临床前验证。构建无载体纳米药物对临床转化而言具有重要意义。作为SN-38的前药,CPT-11已经在临床上广泛应用。SN-38与CPT-11之间由于存在π-π键而表现出强烈的分子亲和力。因此,CPT-11作为辅料与SN-38结合,借由分子亲和力自组装制备得到纳米颗粒,提高了活性成分SN-38的搭载效率,没有额外添加其他非临床应用的药物组分,在设计上也契合“药辅同源”的理念,将具有良好的临床转化前景。第一部分基于7-乙基-10-羟基喜树碱的自组装无载体纳米药物的制备及表征目的:伊立替康（CPT-11）与7-乙基-10-羟基喜树碱（SN-38）之间因存在π-π键而具有强烈亲和力。本研究利用CPT-11和SN-38制备纳米颗粒并对其进行表征。方法:同等质量的SN-38（25 mg）和CPT-11（25 mg）在200μL二甲基亚砜（DMSO）中加热混合均匀,转移到搅拌中的4.8 m L 5%葡萄糖溶液中形成5 m L溶液体系并持续搅拌30分钟,继而进行30分钟的超声（35%w 2s/2s）,最终得到10 mg/m L的S1C1自组装无载体纳米颗粒（S1C1代表SN-38和CPT-11的质量比为1:1）。纳米颗粒的粒子直径由动态光散射仪（Dynamic Laser Scattering,DLS）测定。通过透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）和原子力显微镜（Atomic Force Microscope,AFM）观察纳米颗粒结构。使用4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）配制缓冲液,通过盐酸及氢氧化钠滴定获得不同酸碱度,观察纳米颗粒在不同p H值HEPES溶液中的颗粒稳定性。结果:动态光散射测定S1C1颗粒直径为79.81±7.03 nm,透射电子显微镜和原子力显微镜下观察到S1C1颗粒均匀,直径在80 nm左右。S1C1颗粒在p H=6或者7时,粒径稳定;增大酸度至p H=5时,粒径缓慢变大并于48小时达到600 nm左右;增强碱性至p H=8时,粒径迅速增大,2小时达到2000 nm,12小时达到5000 nm。结论:等质量SN-38和CPT-11通过混合、溶解、搅拌、超声等过程制备得到S1C1纳米颗粒,颗粒分布均匀,在中性偏酸性环境中性质稳定。第二部分基于7-乙基-10-羟基喜树碱的自组装无载体纳米药物对胰腺癌细胞具有杀伤作用目的:S1C1纳米颗粒分布均匀,在中性偏酸性环境中性质稳定。另外,S1C1纳米颗粒提高了SN-38的搭载率,对胰腺癌细胞具有潜在的杀伤作用。本研究通过体内、外实验证实S1C1纳米颗粒对胰腺癌细胞的杀伤作用。方法:通过3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法测定S1C1纳米颗粒对胰腺癌细胞（As PC-1,Bx PC-3,L3.6pl,MIA Pa Ca-2,PANC-1）的细胞毒性,并通过算法拟合计算半抑制浓度（IC50）。通过流式细胞术（FCM）分析S1C1纳米颗粒对胰腺癌细胞（As PC-1,Bx PC-3,L3.6pl,MIA Pa Ca-2,PANC-1）凋亡水平的影响。建立裸鼠胰腺癌皮下荷瘤模型,评估、对比S1C1纳米颗粒和CPT-11的治疗作用,治疗过程中S1C1纳米颗粒与CPT-11均保持15 mg/kg SN-38的换算剂量,并采用每隔3天注射1次（q3d）、第1次注射开始于接种肿瘤细胞后第9天、共计注射5次的治疗方案。通过慢病毒搭载荧光素酶基因感染胰腺癌细胞株L3.6pl构建L3.6pl-luc细胞,用于裸鼠胰腺尾部原位注射,构建胰腺癌裸鼠原位荷瘤模型,通过体外活体成像、肿瘤组织离体后免疫组化,评估、对比S1C1纳米颗粒和CPT-11对裸鼠原位胰腺癌的治疗作用。结果:S1C1纳米颗粒对五种胰腺癌细胞（As PC-1,Bx PC-3,L3.6pl,MIA Pa Ca-2,PANC-1）产生的细胞毒性均明显超过CPT-11,根据有效成分SN-38换算,IC50差异倍数分别为47,110,404,150,4倍。流式细胞术结果显示,SN-38有效质量相等情况下,S1C1纳米颗粒较CPT-11引起更多胰腺癌细胞死亡（p<0.001）。胰腺癌裸鼠皮下荷瘤模型中,腹腔注射S1C1纳米颗粒和CPT-11均可以明显抑制肿瘤生长,肿瘤体积较对照组分别缩小90.42%、73.00%,S1C1纳米颗粒较CPT-11引起更轻的体重减少（p<0.05）和腹泻（没有统计学意义）。此外,同等剂量S1C1纳米颗粒腹腔注射产生的肿瘤抑制效果比静脉注射更好。胰腺癌裸鼠原位荷瘤模型中,与胰腺癌皮下荷瘤模型类似,腹腔注射S1C1纳米颗粒和CPT-11均可以明显抑制肿瘤生长,S1C1纳米颗粒较CPT-11引起更轻的体重减少（p<0.05）和腹泻（没有统计学意义）。治疗过程结束后,肿瘤组织免疫组化提示,S1C1纳米颗粒治疗组裸鼠肿瘤残留病灶较CPT-11治疗组更小。另外,吉西他滨单药治疗方案对裸鼠原位胰腺癌几乎没有治疗作用。结论:基于SN-38的自组装无载体纳米药物S1C1对胰腺癌细胞在体内和体外状态下均具有杀伤作用。第三部分基于7-乙基-10-羟基喜树碱的自组装无载体纳米药物具有良好的临床转化前景目的:腹腔注射纳米药物S1C1和CPT-11均可以明显抑制裸鼠皮下及原位胰腺癌的生长,并且纳米药物S1C1较CPT-11存在轻度提升的胰腺癌治疗效果以及更轻的副作用。然而,CPT-11单药在临床实践中没有表现出胰腺癌明显的治疗作用,原因在于单纯动物荷瘤模型无法真实反应药物对患者可能产生的治疗作用。CPT-11水解成活性SN-38的过程受羧酸酯酶影响,而羧酸酯酶在小鼠动物模型中远远高于胰腺癌患者。本研究通过改善动物模型以模拟患者体内环境,探讨纳米药物S1C1是否可以克服CPT-11疗效临床转化的限制因素而具有良好的临床转化前景。方法:联合应用羧酸酯酶特异性抑制剂Bis-p-nitrophenyl phosphate（BNPP）进行腹腔注射降低小鼠动物模型中的羧酸酯酶水平,模拟人体低羧酸酯酶状态,在裸鼠胰腺癌皮下荷瘤模型和原位荷瘤模型中评估、对比纳米药物S1C1和CPT-11对胰腺癌的治疗效果,BNPP在注射纳米药物S1C1或CPT-11前30分钟注射,纳米药物S1C1和CPT-11的注射剂量、治疗方案均与第二部分保持一致,胰腺癌原位肿瘤模型成像时间为肿瘤细胞接种后第9、15、21、27天。另外,在q3d x 5标准治疗结束后,观察不同治疗组裸鼠的总体生存时间。结合胰腺癌患者多数为晚期的临床现状,依据胰腺癌裸鼠原位肿瘤模型对照组生存时间,建立晚期胰腺癌裸鼠原位肿瘤模型,评估纳米药物S1C1的治疗效果。取用胰腺癌患者组织标本移植于裸鼠皮下构建胰腺癌人源肿瘤异体移植模型（PDX）,通过胰腺癌组织在裸鼠皮下生长、传代形成稳定PDX模型,评估、对比纳米药物S1C1和CPT-11对胰腺癌的治疗效果,其中纳米药物S1C1和CPT-11的注射剂量、治疗方案均与第二部分保持一致。结果:胰腺癌裸鼠皮下肿瘤模型中,联合BNPP腹腔注射降低小鼠动物模型中的羧酸酯酶水平后,腹腔注射纳米药物S1C1、CPT-11组分别较对照组缩小90.73%、59.33%,对比单用纳米药物S1C1或CPT-11治疗时肿瘤体积较阴性对照分别缩小90.42%、73.00%。此外,单纯注射BNPP不产生显著缩小肿瘤效果。胰腺癌裸鼠原位肿瘤模型中,联合BNPP腹腔注射降低小鼠动物模型中的羧酸酯酶水平后,通过成像可见,腹腔注射纳米药物S1C1、CPT-11组肿瘤分别较对照组明显缩小,结束治疗后的第6天成像可见,CPT-11治疗组较纳米药物S1C1组具有明显升高的肿瘤活性。远期来看,联合BNPP和纳米药物S1C1治疗的裸鼠中位生存时间是86天,联合BNPP和CPT-11治疗的裸鼠中位生存时间是61天,对照组小鼠中位生存时间是43天。以裸鼠胰腺癌原位肿瘤模型建立后40天为界限成功建立6只晚期胰腺癌原位肿瘤裸鼠,给予q3d x 5纳米药物S1C1并监测肿瘤变化发现,4只晚期原位胰腺癌裸鼠的肿瘤明显缩小。胰腺癌患者组织标本在裸鼠皮下成功存活,并传代至第4代,成功建立稳定的胰腺癌PDX模型,随机分组并完成q3d x 5标准治疗后发现,腹腔注射纳米药物S1C1比CPT-11组产生更强的肿瘤抑制效果（和对照组比较分别缩小84.10%、46.74%）,此外,纳米药物S1C1较CPT-11引起更轻的体重减少（没有统计学意义）和腹泻（没有统计学意义）。结论:本研究表明,相比CPT-11,纳米药物S1C1对胰腺癌的治疗作用独立于羧酸酯酶的限制,在裸鼠中降低羧酸酯酶水平、模拟胰腺癌患者体内环境不减弱纳米药物S1C1对胰腺癌的治疗效果;纳米药物S1C1对胰腺癌PDX裸鼠模型同样具有治疗作用,具有良好的临床转化前景。