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氧化应激能够导致动物机体发生系统性和代谢性疾病,肠道的抗氧化酶系统在氧化应激中起重要作用。大量研究表明,魔芋甘露低聚糖可以促进肠道有益菌、抑制有害菌的生长,并且具有清除活性氧自由基的能力。枯草芽孢杆菌对动物机体有多种益生功能,在加强机体免疫功能、减小机体氧化应激程度、阻止致病菌的生长定殖等方面具有重要作用。本实验室前期研究发现,魔芋甘露低聚糖对枯草芽孢杆菌的生长有着显著的促进作用,两者联合添加对肠上皮细胞活性、炎性损伤等方面具有明显的修复效果。在前期研究的基础上,本研究利用LPS刺激结肠癌上皮Caco-2细胞,建立细胞氧化损伤模型,探讨魔芋甘露低聚糖和枯草芽孢杆菌对肠上皮细胞氧化损伤的修复作用,并建立LPS诱导的小鼠急性损伤模型,进一步探讨两者联合添加对动物机体的协同修复以及防护作用。主要研究内容如下:1.肠上皮细胞氧化损伤模型的构建。利用不同浓度LPS刺激Caco-2细胞不同时间,检测细胞的氧化和抗氧化指标,研究结果发现,LPS可引起氧化标志物MDA的表达升高,抗氧化酶SOD酶活性降低,最终确定LPS诱导Caco-2细胞氧化损伤的最佳作用浓度是2μg/m L,作用时间为8h。并通过Q-PCR进一步检测氧化酶NADPH的NOX2亚型、抗氧化反应元件Nrf2/Keap1以及下游抗氧化基因SOD1、GPx1的表达,western blot检测Nrf2的表达变化。与对照组相比,LPS能引起NOX2的表达上调,使细胞中产生更多的活性氧;Nrf2表达上调,Keap1表达下调,下游的抗氧化基因SOD1、GPx1和HO-1表达也被上调,说明细胞的Nrf2/Keap1抗氧化酶系统被激活。2.魔芋甘露低聚糖和枯草芽孢杆菌对Caco-2细胞抗氧化功能的影响。研究结果表明:与LPS损伤组相比,魔芋甘露低聚糖处理组细胞培养上清中抗氧化酶SOD酶活性和GSH含量显著提高,但在细胞裂解液中两种抗氧化酶无显著变化。Q-PCR检测表明,魔芋甘露低聚糖对抗氧化基因的表达也无显著影响,这提示魔芋甘露低聚糖在细胞培养中发挥抗氧化作用可能更多的是通过自身的理化性质与细胞中的自由基等反应,并没有介入到细胞的抗氧化系统中。与LPS损伤组相比,在枯草芽孢杆菌处理组细胞上清和裂解液中,SOD酶活性和GSH含量均显著增加。与对照组相比,枯草芽孢杆菌阳性对照组Nrf2和下游抗氧化基因SOD1、GPx1的表达显著上调;与LPS损伤组相比,枯草芽孢杆菌处理也能够使Nrf2和下游抗氧化基因SOD1、GPx1的表达显著上调。这提示枯草芽孢杆菌可能通过影响细胞的Nrf2信号通路上调抗氧化基因的表达,提高细胞的抗氧化功能。与LPS损伤组相比,寡糖和益生菌联合处理组中MDA的表达下调,SOD酶活性和GSH含量增加;与益生菌单独处理组相比,寡糖和益生菌联合添加能够下调MDA的表达和上调SOD酶活性,对GSH的含量则无显著影响。3.魔芋甘露低聚糖和枯草芽孢杆菌对小鼠肠道抗氧化功能的影响。(1)与LPS损伤组相比,添加寡糖对小鼠肝脏中T-AOC、SOD、GSH三种抗氧化物活性均有显著地提升,添加益生菌能显著提升超氧化物歧化酶和总抗氧化酶的活力,而对肝脏中GSH的含量无显著影响。寡糖和益生菌联合处理能显著提高肝脏中三种抗氧化酶活性,且比单独添加益生菌的组别效果更显著。(2)相比LPS损伤组,寡糖和枯草芽孢杆菌灌胃均能显著降低小鼠血清中MDA的含量,且两者联合灌胃效果更显著。小鼠回肠HE染色显示,LPS诱导后,小鼠回肠组织产生了明显的损伤,肠绒毛断裂,组织固缩;加入寡糖和枯草芽孢杆菌均能不同程度地修复小鼠回肠组织的损伤。(3)添加枯草芽孢杆菌和魔芋甘露低聚糖均可明显抑制小鼠回肠中炎性因子TNF-α、IL-6的表达,且寡糖和益生菌联合处理效果更显著。(4)与LPS损伤组相比,小鼠灌胃处理组(三组)中GSH含量和SOD酶活性均有显著提升。灌胃处理组均能显著抑制由LPS引起的小鼠肠道氧化基因NOX2的上调,并且两者联合灌胃组比单独灌胃寡糖或者益生菌下调更明显。灌胃处理组对LPS抑制机体抗氧化酶系统的表达也具有良好的防护效果。(5)通过western blot检测Claudin-1蛋白的表达,发现:相比LPS损伤组,预灌胃寡糖和枯草芽孢杆菌能显著上调Claudin-1蛋白的表达,说明枯草芽孢杆菌和魔芋甘露低聚糖对LPS引起的肠道紧密连接损伤具有良好的防护作用。综上所述,LPS可引起结肠癌上皮Caco-2细胞氧化应激损伤;枯草芽孢杆菌、魔芋甘露低聚糖及其联合使用均能提升细胞的抗氧化功能;枯草芽孢杆菌与魔芋甘露低聚糖联合添加比单独使用益生菌、魔芋甘露低聚糖效果更明显。灌胃枯草芽孢杆菌和魔芋甘露低聚糖对LPS急性损伤小鼠模型具有良好的防护效果。