研究背景 自20世纪80年代DNA分型技术问世以来,法庭科学领域产生了重大变革,作为刑事科学技术的一个重要组成部分——法医DNA技术在打击犯罪中发挥着越来越重要的作用。利用DNA技术可以对犯罪现场提取的各类生物检材进行鉴定,包括毛发、精液、骨骼、烟头、衣物等现场物证(斑迹或组织)。随着法医DNA技术的蓬勃发展,微量DNA或降解的DNA样本检验也能得到较理想的分型。混合斑是常见的非单一来源且组分不确定的生物物证,尤其存在大量高度不平衡的混合DNA样本,在实际工作中,它们给检验鉴定工作带来极大困难,甚至导致检验结果无法有效支撑案件侦办。现代法医物证实验室常规的检测方法是基于广泛分布于常染色体DNA上的具有良好多态性的短串联重复序列(short tandem repeat,STR)位点原理,但该方法通常在混合DNA样本组分比例超过10﹕1时,便无法准确读取次要供体DNA的分型结果。例如,性侵和暴力犯罪等案件中的供体DNA比例不均衡,常规STR检测方法难以获得混合DNA中次要供体的分型信息。造成这些现象的原因主要是混合斑中受害者的DNA与犯罪嫌疑人DNA比例不均衡导致PCR扩增掩蔽效应,主要供体DNA样本信号干扰次要供体DNA次要供体DNA样本,使得混合样本中较微量的DNA样本无法得到充分扩增和检测从而得出分型,以致影响鉴定结果的出具和案件侦办,甚至在诉讼环节无法起到有效的证据作用。近年来研究表明新型连锁遗传标记DIP-STR,即将缺失或插入多态性片段DIP(deletion insertion polymorphisms,DIP)和短串联重复序列STR的遗传标记相结合,利用法医实验室现有的分型检测设备,通过连锁标记等位基因特异性引物可以靶向结合混合DNA样本中次要的DNA进行PCR扩增,以打破扩增掩蔽效应。具有良好灵敏性的DIP与具有多态性的STR连锁,使得DIP-STR标记具备较高的灵敏度、特异性,即使在混合DNA样本混合比例高达1000﹕1时,仍然可以得到相对理想的结果。该方法不但打破了扩增掩蔽效应,还不受混合斑中DNA供体的性别限制。因此该技术在解决混合DNA检验的难题上被认为有较大的潜力。然而,目前国内外报道的DIP-STR遗传标记数量十分有限,大大限制了其辨别能力和实战应用,为了解决这个问题,亟需探索更多的DIP-STR位点并构建DIP-STR标记组,以利用足够的基因座实现较高的辨别能力。目的 筛选并验证新的DIP-STR遗传标记,优化连锁标记扩增体系,构建一体化的技术平台,进一步探索该类遗传标记在不平衡混合DNA样本中应用的潜力。方法 (1)通过查阅数据库和文献,结合文献报道的研究方法,制定筛选标准并预筛标记位点。(2)根据预筛出的位点,利用Primer 3软件设计目标位点的特异性引物,构建扩增体系;DNA产物测序比对以优化对应引物及体系,进一步筛选位点。(3)随机采集200名中国人群个体样本,对二次筛选所得位点进行多态性检验并利用Powerstats V12(Promega)软件,计算DIP-STR等位基因频率和DIP-STR基因型相应的随机匹配概率;结合群体数据结果和测序结果设计DIP-STR专用的Panel、bins各项参数以实现自动化分析。(4)利用不同浓度梯度的单一来源DNA样本,探究各单一标记的检测阈值。(5)模拟制备两个个体不同配比的混合DNA样本,进行DIP-STR遗传标记的灵敏度检测。结果 (1)在预筛出的5个DIP-STR遗传标记位点中,有3个位点扩增检测结果理想且信息性标记概率(I值)较高,表明其在个体识别方面有一定的应用前景。(2)经实验分析,上述3个位点间的遗传多态性及个人识别能力不同,可进一步在实际案件检验中试用。(3)单一来源DNA样本的检测阈值最低可至0.005ng。(4)通过DIPSTR遗传标记和常染色体STR遗传标记的比较研究发现:混合样本中,当组分倍比差异增大时,常染色体STR标记由于大量的主要供体DNA干扰难以对次要供体的微量DNA进行基因型鉴定,而DIP-STR遗传标记则体现出一定的优越性,最高可在1﹕1000的比例下检测到次要供体的微量DNA。结论 通过筛选,本研究获得了3个灵敏度和特异性均较好的DIP-STR遗传标记,其在一定人群中也表现出较好的多态性,它们在混合DNA样本尤其是不平衡混合DNA样本检验中具有一定的应用价值。