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第一部分咖啡酸抑制食管鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭目的:我们课题组已筛选出ALDHbri+的食管鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）肿瘤干细胞亚群,并发现该亚群KDM4C高表达,敲降KDM4C后ALDHbri+亚群细胞恶性增殖、自我更新、体内成瘤等干细胞生物学特征较前显著降低,提示KDM4C是ESCC潜在的分子治疗靶点。多项研究表明:咖啡酸不仅具有抗炎、免疫调节、升白细胞、血小板等功能,还具有抑制多种肿瘤增殖、侵袭、转移的抗肿瘤作用,但在食管鳞癌方面未见报道。因此,该研究旨在探讨咖啡酸对ESCC细胞增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为的抑制作用。方法:用慢病毒感染方法建立荧光素酶标记的稳定过表达KDM4C的ESCC细胞KDM4C KYSE30,稳定敲降KDM4C的ESCC细胞shKDM4C KYSE150。RT-PCR和Western blot检测稳定过表达/敲降细胞中KDM4C表达,检测过表达及敲降效率。用5 umol/L、10 umol/L、20 umol/L、50 umol/L咖啡酸处理shCon KYSE150、shKDM4C KYSE150和低表达KDMC4的KYSE30细胞,CCK 8试剂盒检测细胞增殖变化,计算IC50。用20 umol/L咖啡酸处理shCon KYSE150、shKDM4C KYSE150、KYSE30细胞,用不含基质胶与含有基质胶的两种Transwell小室分别检测细胞迁移、侵袭能力变化。将裸鼠分为对照组、咖啡酸处理组,分别将对数生长期荧光素酶标记的shCon KYSE150、shKDM4C KYSE150、Con KYSE30、KDM4C KYSE30细胞接种在裸鼠肩背部皮下,成瘤后隔日分别给与咖啡酸处理组100 ul质量浓度为100 mg/Kg咖啡酸（3g/L羟甲基纤维素钠溶解制备）、对照组等体积3g/L羟甲基纤维素钠腹腔注射,每周2次测量肿瘤最长径、最短径,第35天小动物活体成像检测皮下荷瘤生长,然后脱颈法处死老鼠终止实验,剥离肿瘤并称重,计算肿瘤体积、绘制肿瘤增长曲线,用独立样本t检验对皮下荷瘤体积、重量及荧光强度等数据进行统计分析。结果:1.建立了shKDM4C KYSE150和KDM4C KYSE30稳定细胞系;与对照组Con KYSE30细胞相比,KDM4C KYSE30中KDM4C mRNA表达增加了5.8倍,与对照组shCon KYSE150细胞相比,shKDM4C KYSE150中KDM4C m RNA表达降低了0.74倍;2.与对照组Con KYSE30细胞相比,KDM4C KYSE30中KDM4C蛋白表达增加了1.1倍,与对照组shCon KYSE150细胞相比,shKDM4C KYSE150中KDM4C蛋白表达降低了0.7倍;3.5 umol/L、10 umol/L、20 umol/L、50 umol/L咖啡酸处理KYSE30、shCon KYSE150、shKDM4C KYSE150细胞后,ESCC细胞增殖显著降低,并呈剂量依赖性,IC50分别为32.51 umol/L、23.31 umol/L、38.21 umol/L;4.KDM4C敲降后,迁移、侵袭至小室基底面的shKDM4C KYSE150细胞明显减少（P<0.05）;5.20 umol/L咖啡酸处理后,细胞迁移的抑制率分别为:shCon KYSE150=65.88%（P<0.0001）;shKDM4C KYSE150=36.51%（P=0.0009）;KYSE30=35.38%（P=0.0085）;细胞的侵袭抑制率分别为:shCon KYSE150=67.65%（P<0.0001）;shKDM4C KYSE150=36.99%（P<0.0001）;KYSE30=37.66%（P<0.0001）,均具有统计学意义;6.咖啡酸处理裸鼠皮下荷瘤结果显示,KDM4C敲降后明显降低KYSE150皮下荷瘤生长,实验结束时皮下肿瘤体积（P<0.05）、重量（P=0.0014）、荧光强度（P=0.0006）较shCon KYSE150均显著降低;咖啡酸处理后各组皮下肿瘤体积、质量、荧光强度较对照各组均明显减轻（P<0.05）。进一步计算肿瘤质量抑制率,显示KDM4C高表达的shCon KYSE150抑制率（74.80%）大于敲降的shKDM4C KYSE150（39.7%）,咖啡酸对过表达KDM4C细胞KYSE30的抑制率（61.53%）大于对应的低表达KDM4C的KYSE30对照细胞（30.39%）。结论:基于上述基础实验结果,我们得出结论:咖啡酸能够抑制ESCC细胞增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为,且咖啡酸对KDM4C高表达ESCC细胞的抑制作用大于KDM4C低表达的ESCC细胞,提示咖啡酸是潜在的新型ESCC抑制药物,为咖啡酸治疗食管鳞癌的临床应用提供了实验依据。第二部分咖啡酸治疗KDM4C低表达中国晚期/复发食管鳞癌患者的多中心、双盲、随机对照研究目的:基于前期基础实验结果,我们证明了咖啡酸能够显著抑制体外ESCC细胞的增殖、侵袭、迁移以及体内皮下荷瘤的生长,为了进一步评估咖啡酸治疗ESCC患者的疗效及安全性,我们注册申请了题目为“咖啡酸治疗中国晚期/复发食管鳞癌患者的的多中心、双盲、随机对照研究”的临床试验。本课题是其子课题之一,旨在评价咖啡酸对KDM4C低表达的中国晚期/复发食管鳞癌患者的疗效、安全性、生活质量。方法:在各个研究中心筛选符合入组标准的病理确诊为IV期食管鳞癌或食管鳞癌复发患者,签订知情同意书后加入该临床试验。咖啡酸治疗前收集病人血液标本和胃镜活检/手术切除的组织标本,于河南科技大学第一附属医院分子生物实验室用免疫组化方法检测ESCC组织中KDM4C表达水平。我们中心联合药品制造商对咖啡酸片、安慰剂片进行随机化编号,入组患者按照药物编号发放药品（成分为咖啡酸片或安慰剂片）:一次0.3g（3片）,一日3次,口服,需长期服药,直至病人出现不可耐受的毒副作用或死亡。随访期间每2周复查血常规,每8周复查肝功能、肝酶学、血脂等指标检测药物毒副反应,随时记录不良事件,每8周复查食管影像学、填写生活质量问卷以评价疗效和生活质量。用SPSS 24.0软件对数据进行统计分析,计量资料以±SD表示,计数资料选用t检验或秩和检验,计量资料选用卡方检验、Fisher精确检验,检验水准α=0.05,P<0.05具有统计学意义。结果:于2017年6月完成临床试验注册,临床试验号为NCT03070262。于2018年10月该临床试验相继在洛阳、安阳、南阳、开封、郑州等中心顺利启动。截止2019年3月12日各研究中心共入组患者25例,死亡7例,KDM4C高表达11例,低表达14例。因研究尚未结束,并未揭盲,无法进一步统计咖啡酸组、安慰剂组数据,并评价药物疗效、药物相关不良反应及生活质量前后差异。目前数据显示:KDM4C低表达组1-2级症状学不良事件发生率较低,低血压1例,盗汗1例,血液学不良反应轻微,发生率均小于50%,且为1-2级不良反应,无3-4级不良事件发生,无致死性不良事件发生。用药前后KDM4C低表达组患者的生活质量在社会功能、总健康状况两个领域,疲倦、恶心与呕吐、气促、腹泻四个症状领域较前好转,其中疲倦疲领域好转趋势明显（P=0.066）,情绪功能、认知功能、疼痛、失眠、便秘领域较前评分无明显变化,躯体功能、角色功能、食欲丧失、经济困难4个领域较前变差,但均无统计学差异（P>0.05）。结论:目前临床试验进行中尚未揭盲,咖啡酸疗效评价及生活质量对比分析,目前暂时无法评估。根据当前数据结果,我们可以得出结论:咖啡酸/安慰剂对KDM4C低表达的晚期/复发食管鳞癌患者是安全的,并未增加额外的不良反应。