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细菌性腹膜炎伴随炎症过度反应发生的实质是机体内引发细胞因子风暴,是免疫细胞快速地产生大量的抑炎性细胞因子和促炎性细胞因子的过程,而在这一过程中,中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)是作为宿主防御的第一道防线的免疫细胞,发挥抗炎作用;随着病程的进展,PMN通过释放一系列促炎介质,引发细胞因子风暴而加重炎症反应。因此,中性粒细胞在炎症过度性疾病中具有双面功能,既有抗炎特性又有促炎特性。课题组在前期工作中发现,在MPLA介导的炎症预适应作用下,PMN内通过TLR9识别病原体相关分子模式(PAMPs)或危险相关分子模式(DAMPs),TLR9激活后从内体转移至细胞膜,与膜上的小窝蛋白-1(Cav-1)结合并发生偶联后,激活具有抗炎特性的中性粒细胞亚型,即mTLR9+PMN。前期通过大量实验研究验证了mTLR9+PMN是此保护作用中的关键效应细胞,保护机体避免炎症过度的伤害。这提示我们研究mTLR9+PMN内的信号通路及机制,应对抗炎通路中的抗炎因子做深一步的研究。在炎症反应中的巨噬细胞极化方式的研究中,发现干扰素调节因子(Interferon regulatory factors,IRFs)扮演着不可或缺的角色,尤其是IRF4和IRF5在调控抗炎表型巨噬细胞(M2)和促炎表型巨噬细胞(M1)极化过程中起到重要作用。IRF4与IRF5竞争性结合MyD88是巨噬细胞走向M2和M1表型的决定性因素,M1型巨噬细胞内高表达IRF5与MyD88结合,诱导大量促炎因子的产生,如TNF-α、IL-6等;M2型巨噬细胞高表达IRF4与MyD88结合,产生大量的抑炎因子如IL-10、IL-4、IL-1等参与宿主的抗炎反应,同时抑制促炎因子的产生,从而避免炎症过度的发生。目前,由于IRFs在中性粒细胞的功能及释放因子的基因转录调控等方面的研究较少。基于以上研究,我们从IRFs在mTLR9+PMN内的抗炎机制入手,并提出进一步猜测,在细菌性腹膜炎这一炎症过度性疾病中,mTLR9+PMN通过诱导IRF4/MyD88/IL-10抗炎通路,发挥抑制炎症作用,以及IRF5/MyD88/TNF-α促炎通路,促进炎症的发生发展,通过这两条信号通路之间的较量,进而决定着宿主的命运。因此,我们认为在MPLA介导的炎症预适应中,mTLR9+PMN激活IRF4/MyD88/IL-10抗炎通路,同时抑制促炎因子的释放而对细菌性腹膜炎小鼠具有一定的保护作用。鉴于此,本课题组应用大肠杆菌诱导的细菌性腹膜炎模型小鼠、MPLA介导的炎症预适应小鼠、以及TLR9和Cav-1基因敲除小鼠(tlr9-/-和cav-1-/-小鼠)。通过观察小鼠生存期、小鼠组织病理学变化、蛋白及炎症因子的表达情况等,探讨MPLA通过激活mTLR9+PMN进而调节IRF4/IRF5与MyD88信号通路的作用机制。与此同时,本课题组通过构建转基因斑马鱼Tg(Tol2-EF1α:MyD88-EGFP-PA),进而获得MyD88过表达的斑马鱼模型,以便接下来在基因功能上做深一步的信号通路研究,为细菌性腹膜炎的预防和治疗提供新的科学依据及科研思路。实验结果如下:(1)TLR9在MPLA介导的炎症预适应下的作用:应用tlr9-/-小鼠建立InP模型(n=8)。tlr9-/-InP小鼠生存率显著降低:小鼠在72 h内只存活1只;tlr9-/-InP小鼠肠组织同模型组一样出现严重的病理损伤;将野生型小鼠InP作用下的PLCs过继转移至tlr9-/-小鼠腹腔内,有5只小鼠存活,提高了小鼠生存率;TLR9敲除后InP组中TLR9/MyD88蛋白和促炎因子TNF-α和IL-6的表达显著降低。(2)Cav-1诱导mTLR9在InP中的预保护作用:应用cav-1-/-小鼠建立InP模型(n=8)。cav-1-/-InP小鼠生存率显著降低:小鼠在72 h内死亡5只;cav-1-/-InP小鼠肠组织同模型组一样出现严重的病理损伤;Cav-1敲除后InP组未见细胞膜TLR9蛋白的表达;以及Cav-1敲除后InP组中促炎因子TNF-α和IL-6的表达显著降低。(3)IRF4/IRF5在MPLA介导的炎症预适应下的作用:应用WT小鼠建立InP模型(n=8)。InP组中,随着MPLA作用时间的延长,IRF4的表达逐渐增加,IFR5的表达逐渐降低,IRF4与IRF5的比值逐渐升高;免疫共沉淀法检测IRF4和IRF5与MyD88在InP作用下存在共表达;MPLA介导的InP中,细胞核内IRF4高表达,同时抑制IRF5入核表达;InP作用下增加IL-10的分泌,而减少TNF-α的分泌。(4)转基因斑马鱼Tg(Tol2-EF1α:MyD88-EGFP-PA)的构建:利用Tol2转座子成功构建MyD88过表达的重组质粒,与Tol2转座酶(TP m RNA)一起显微注射至斑马鱼单细胞胚胎内,成功筛选出眼睛、血管、脊柱、脑组织等全身多处表达绿色荧光蛋白的胚胎,饲养至性成熟后建立F0代,便于日后筛选鉴定出可稳定遗传的F1代鱼以及纯合子F2代转基因斑马鱼。