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背景:心肌缺血/再灌注损伤(MIRI)是指心肌缺血一定时间后冠脉再通反而加重原来的心肌损伤的现象。MIRI的机制较为复杂,尚未完全阐明,现有研究认为自由基损伤、钙超载、内皮细胞损伤、心肌能量代谢障碍都参与了MIRI的过程。此外,研究表明炎症因子水平的高低与缺血后心脏功能损伤及心肌细胞坏死数量有关,推测炎症反应在MIRI中也起到了非常重要的作用。P2X7R能够在心肌细胞表达,且心肌损伤时表达上调,当细胞损伤时释放的ATP可以激活P2X7R,进而活化NLRP3,激活下游通路,促进促炎因子IL-1β、IL-18的分泌,进一步扩大炎症反应。微囊泡(MV)是细胞激活或凋亡时释放到胞外的直径为100 nm-1μm的膜性囊泡,能够介导细胞之间的信息传递。在神经系统的研究表明,MV的产生与P2X7R的激活密切相关。雷诺嗪是治疗室性心律失常和心绞痛的临床用药,其保护心肌缺血的作用机制尚未完全明确。目前关于在MIRI中MV是否参与了P2X7R-NLRP3介导的炎症反应以及雷诺嗪对MIRI时炎症反应的影响还不清楚。目的:探讨MV是否参与了MIRI时P2X7R-NLRP3介导的炎症反应以及雷诺嗪是否能够通过免疫炎症调节起到抗MIRI作用。方法:一、H9C2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型的建立及MV的提取和鉴定(1)H/R诱导H9C2心肌细胞损伤模型的建立:体外培养H9C2心肌细胞,采用不同的缺氧/复氧(H/R)时间处理细胞,通过MTT检测细胞存活率选择适宜的缺氧/复氧时间,流式凋亡检测进一步确定细胞损伤程度,建立H/R诱导H9C2心肌细胞损伤的模型;(2)H/R诱导H9C2细胞产生MV的鉴定及定量检测:接种到培养瓶的H9C2细胞达到融合后,弃上清换用缺氧液,于密闭缺氧装置中缺氧培养4 h,继而复氧培养3 h。利用超速离心法从培养上清中收集MV,并用电子显微镜及激光共聚焦观察细胞对MV的摄取对其进行鉴定,采用流式细胞仪通过标准微球对MV进行计数,采用BCA法对MV进行蛋白定量,Western blot法检测MV中的目的蛋白。二、药物对H/R诱导心肌细胞损伤的干预(1)雷诺嗪对H/R诱导H9C2细胞损伤的干预:接种到培养板的H9C2心肌细胞达到融合后,换用无FBS培养基培养12 h,分为对照组(control,对照液)、模型组(H/R,缺氧液)及雷诺嗪预处理组(RAN,缺氧液+雷诺嗪)3组。应用RT-PCR法测定P2X7R、Caspase-1、NLRP3 mRNA表达,Western blot法测定P2X7R、Caspase-1、NLRP3蛋白表达,酶联免疫法(ELISA)检测细胞上清液IL-1β、IL-18水平,流式进行上清中MV计数;(2)体外培养大鼠原代心室肌细胞,分为四组:对照组(control,对照液)、对照抑制组(control inhibit,对照液+A438079)、模型组(H/R,缺氧液)及模型抑制组(H/R inhibit,缺氧液+A438079),Western blot法测定P2X7R的蛋白表达,流式计数上清中MV的数量,激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+浓度。三、雷诺嗪对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的干预作用(1)建立大鼠心肌缺血/再灌注模型:采用开胸结扎冠状动脉前降支的方式造成大鼠心肌缺血,缺血30 min后再灌注2 h;(2)雄性Wistar大鼠60只,平均体重250-300g,随机分为三组,假手术组(sham),手术组(I/R),盐酸雷诺嗪预处理组(RAN),每组20只。I/R组及RAN组在手术过程中结扎冠状动脉前降支30 min后松开结扎线,再灌注2 h,sham组放置处理2 h 30 min。大鼠处死后心室取血用以测量血清中的HMGB1、LDH、IL-1β和IL-18的含量以及血浆中MV的数量。留取缺血区心肌组织用于Western blot法检测缺血区心肌P2X7R、NLRP3、Caspase-1及HMGB1的蛋白表达,同时行HE染色观察缺血区心肌组织,免疫组织化学方法检测其中NLRP3和HMGB1的表达。结果:一、H9C2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型的建立及MV的提取和鉴定(1)H/R诱导H9C2心肌细胞损伤模型的建立:在缺氧4 h复氧3 h处理后,H9C2心肌细胞出现皱缩、变形,与control比较,MTT检测细胞存活率显著降低(73.89±5.90 vs 100%±0%,P<0.05),且流式检测凋亡率为24.17%±2.31%,损伤程度适中,实验结果稳定,适宜采用该模型诱导H9C2细胞损伤;(2)H/R诱导H9C2细胞产生MV的鉴定及定量检测:通过缺氧4 h复氧3 h诱导H9C2细胞释放MV,电子显微镜观察发现为直径100 nm-1μm的圆形膜性囊泡结构,证明其为来源于H9C2细胞的MV。用PKH67标记MV后,分别加入至正常培养的H9C2细胞、HL-1细胞、Vfib细胞及HUVECs中培养24h后激光共聚焦显微镜观察发现MV被上述细胞摄取。Wstern blot结果显示MV中可以表达β-Tublin、IL-1β和IL-18,BCA法测定MV中的总蛋白浓度为0.15±0.09μg/μL。二、药物对H/R诱导心肌细胞损伤的干预(1)雷诺嗪对H/R诱导H9C2心肌细胞损伤的干预:RT-PCR结果显示I/R组较control组P2X7R、Caspase-1、NLRP3 mRNA表达明显增多(p<0.05);Western blot结果显示H/R组较control组P2X7R、Caspase-1、NLRP3蛋白表达明显增多(p<0.05),RAN组与H/R组相比P2X7R、Caspase-1、NLRP3蛋白表达显著下降(p<0.05);细胞上清中检测到的MV数量,H/R组较control组明显增多(p<0.05),RAN组较H/R组MV数量明显减少(p<0.05)。三组细胞上清中的IL-1β、IL-18含量无差异。(2)Western blot法测定各组P2X7R的蛋白表达,结果显示CI组较control组、H/RI组较H/R组P2X7R的表达均下降(p<0.05);激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+浓度,CI组较control组、H/RI组较H/R组Ca2+浓度均下降;流式计数上清中MV的数量,H/RI组较H/R组MV计数显著减少(p<0.05),CI组与control组无差异。三、雷诺嗪对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的干预作用(1)建立大鼠心肌缺血/再灌注模型:开胸结扎大鼠冠状动脉前降支后可见体表心电图II导联ST段弓背样抬高,再灌注时逐渐回落;台盼蓝/TTC双染色可观察到心肌缺血区和梗死区;小动物超声观察可见缺血期有室间隔和心尖部的阶段性运动异常;I/R组缺血期间、再灌注期间室性心律失常发生次数较sham组明显增多(p<0.05),RAN组较I/R组室性心律失常发生次数显著减少(p<0.05)。(2)缺血区心肌组织Western blot结果显示,I/R组P2X7R、NLRP3、Caspase-1及HMGB1的蛋白表达较sham组明显增多(p<0.05),RAN组较I/R组上述蛋白表达量显著下降(p<0.05);免疫组化显示H/R组较sham组缺血区HMGB1及NLRP3阳性颗粒增多(p<0.05);RAN组较H/R组缺血区NLRP3阳性颗粒明显减少(p<0.05);I/R组较sham组血清中HMGB1及IL-1β含量明显升高(p<0.05),RAN组较I/R组HMGB1及IL-18含量下降(p<0.05);I/R组较sham组血浆中MV数量明显增多(p<0.05),RAN组较I/R组MV数量较I/R组明显下降(p<0.05)。结论:1.缺氧4 h复氧3 h可以成功诱导H9C2细胞的损伤产生MV2.雷诺嗪可以减轻H/R诱导的H9C2心肌细胞损伤的炎症反应,是通过抑制P2X7R-NLRP3-Caspase-1及MV的产生实现的;3.P2X7R的激活在H/R诱导心肌细胞产生MV中起到重要作用;4.成功建立大鼠MIRI模型,雷诺嗪可以通过抑制P2X7R-NLRP3-Caspase-1减少循环血中IL-1β及MV的含量,抑制心肌缺血/再灌注时的炎症反应,减轻心肌损伤。