论文部分内容阅读
研究目的:肾细胞癌是泌尿系统中常见的恶性肿瘤,起病隐匿,早期没有明显典型的临床症状,部分患者在确诊的时候癌细胞就已经发生侵袭转移,而晚期肾癌对放化疗均不敏感,靶向治疗易产生耐药,所以早诊断早治疗是目前有效防治肾癌的最佳手段。ncRNA作为一大类广泛存在而不转录成蛋白质的RNA,其作用机制及生物学功能正越来越多的被发掘和研究,microRNA作为一类分子量为18到24核苷酸的微小ncRNA,在肿瘤发生发展中起到至关重要的作用,而完整的miRNA从产生到发挥作用、自上而下的调控通路在肾细胞癌中罕有详细报道。因此,我们以此为契机,探索特异性转录因子/microRNA/关键作用蛋白通路在肾细胞癌中的促癌/抑癌作用以及其详细机制,寻找关键分子标志物,为肾癌有效诊断及治疗奠定理论基础。研究方案:1.肾细胞癌中高表达microRNA的筛选及检测搜索TCGA、GEO等网上公共数据库,筛选在肾细胞癌中高表达的miRNA,挑选表达丰度高、上调明显、未被研究过的miRNA。从标本库中随机选取92例病理诊断明确的肾细胞癌病例,提取癌组织及癌旁组织的总RNA,利用PCR技术检测miRNA表达趋势。培养各肾癌细胞系及永生化正常肾小管上皮细胞系,分别提取各自总RNA,并检测miRNA表达量,选取稳定高表达的miRNA2.miRNA在肾癌细胞系中的功能实验构建miRNA的模拟物/抑制物及其对应的阴性对照。分别转染肾癌细胞系,利用CCK-8增殖实验及平板克隆实验检测转染后细胞增殖能力。运用流式细胞仪技术,通过检测转染miRNA模拟物/抑制物的细胞的FITC标记的Annexin V和Propidium Iodide,统计凋亡细胞数目,判断miRNA对癌细胞凋亡能力的影响。进行裸鼠皮下成瘤实验,在4-6周Balb/c裸鼠皮下注射转染后的肾癌细胞,观察移植瘤模型的生长情况,并对比不同组别生长情况。取移植瘤进行免疫组化,检测Ki-67变化以判断mi RNA对增殖能力的影响,并行Tunel凋亡实验检测不同组别瘤细胞中细胞凋亡情况。3.miRNA对下游靶蛋白的调控作用及机制利用生物信息学网站,预测并筛选适应条件的靶蛋白,分别检测转染mi RNA模拟物/抑制物后的细胞中靶蛋白的mRNA/蛋白水平变化回复实验检测miRNA和DAPK1对细胞凋亡及增殖的影响根据预测的位点,构建双荧光素酶报告基因质粒,判定miRNA与目的蛋白mRNA3’UTR区特异性结合4.上游转录因子对miRNA的调控作用及机制利用生物信息学预测网站,筛选miRNA上游符合条件的转录因子,内外源性调节转录因子,检测miRNA变化。构建转录因子和miRNA转录启动区域的双荧光素酶报告质粒,比较荧光定量变化;根据结果,进行染色质转录因子结合免疫沉淀实验（ChIP）,验证转录因子与miRNA上游启动区域特异性结合并发挥转录活性。5.转录因子与靶蛋白互相调控作用及机制内外源性调节转录因子后,检测靶蛋白的mRNA及蛋白水平变化调节靶蛋白表达量,检测转录因子活性等变化,利用免疫荧光等技术深入探究转录因子活性变化的机制研究结果:1.通过公共数据库成功检出若干miRNA,并进行一系列检测后最终筛选出Hsa-miR-93为研究对象,qRT-PCR验证其在肾细胞癌组织及细胞系较之相对应的癌旁组织及正常上皮中高表达。2.体外试验上调miR-93后,肾癌细胞系增殖能力增强,凋亡下降;下调miR-93后,肾癌细胞系增殖能力消弱,凋亡上升。同样在裸鼠体内实验中证实了上调miR-93可以使移植瘤生长加快,凋亡减少。3.生物信息.预测DAPK1蛋白可作为miR-93下游靶基因,miR-93上调后,DAPK1的蛋白水平下降,而miR-93下调后,DAPK1的蛋白水平明显上升,双荧光素酶报告基因实验证实miR-93可以特异性结合到DAPK1-mRNA的3’UTR区,并介导DAPK1蛋白水平表达,从而调控肾癌细胞的凋亡增殖。4.生物信息预测STAT3作为转录因子调控miR-93表达,内源性激活/抑制STAT3调控miR-93表达量升高/降低,外源性过表达/沉默STAT3亦可产生同样变化。5.双荧光素酶报告基因实验及染色质免疫共沉淀证实IL-6-STAT3通路活化后入核特异性结合到miR-93上游启动区域,发挥转录作用。6.STAT3与DAPK1相互抑制调控肾癌细胞的增殖及凋亡能力。活化/过表达STAT3在mRNA及蛋白水平上均能下调DAPK1的表达,反之,抑制/静默STAT3能上调DAPK1的表达。过表达DAPK1能阻止pSTAT3Y705入核,发挥致癌作用。结论:STAT3/miR-93/DAPK1环路调控肾癌细胞增殖及凋亡能力。STAT3上调miR-93的表达,miR-93可特异性结合到DAPK1-mRNA的3’UTR区抑制DAPK1的抑癌作用,而DAPK1与STAT3相互抑制并共同调控肾细胞癌细胞系的增殖与凋亡。结论:在肾癌组织中,STAT3活化入核转录调控mi R-93的表达量上升,miR-93可以促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,而这一致癌作用是通过介导DAPK1蛋白水平的表达所引起的,STAT3亦可直接调控DAPK1的核酸及蛋白水平;而细胞过表达DAPK1后,又可以反过来影响STAT3活化功能通路,阻碍pSTAT3Y705的核聚集,削弱其致癌作用。因此,STAT3/miR-93/DAPK1通路可以调控肾癌细胞的增殖与凋亡。