三节指节拇指—并多指综合征(triphalangeal thumb polysyndactyly syndrome，TPTPS，MIM 190605)是一种呈常染色体显性遗传的肢端畸形，表现为在第1指即大拇指的位置出现一个或多个具有三节指节的类似大拇指结构，同时在第3，4和5指间存在并指，而第2指往往受累较轻。1994年，TPTPS和轴前多指／三节指节拇指(preaxial polydactyly／triphalangeal thumb，PPD／TPT)两种都表现三节指节拇指的肢端畸形的致病基因同时被定位于染色体7q36区域。进一步扩大家系进行的连锁分析将PPD／TPT基因的关键区域缩小到450kb并排除了SHH基因。通过比较基因组和转基因动物的定位分析实验发现，此区域内LMBR1(limbregion 1)／C70RF2基因第5内含子中存在大约800bp的极化活性区(zone ofpolarizing activity，ZPA)调控序列(ZPA regulatory sequence，ZRS)，在它控制下的LacZ报告基因在肢芽后缘ZPA区域有特异性表达。随后，研究人员在Hx(hemimelic-extra toes)和M100081突变鼠以及4个人类PPD／TPT家系中发现了ZRS的点突变，证实了这个ZRS作为SHH顺式增强因子在PPD／TPT中的致病作用。在TPTPS家系中进行的定位研究仅能确定致病基因位于包含PPD／TPT关键区域和SHH基因的染色体7q36区域，范围较大。在TPTPS患者表型中出现TPT、IV型(Haas型)并指和胫侧半肢畸形-多并指-三指节拇指综合征(tibialhemimelia-polysyndactyly-triphalangeal thumb syndrome，THTPTTS，MIM 188770)共存的事实提示，TPT、TPTPS、Haas-型并指和THPTTS可能是同一种遗传机制导致的不同表现形式。但迄今为止，TPTPS致病基因仍然未知。对TPTPS进行深入的分子遗传学研究，将会有助于揭示TPT相关肢端畸形的发生机制，为这种严重出牛缺陷的基因诊断和产前诊断提供依据。我们发现并收集了两个中国人TPTPS家系，家系中受累个体具有典型的TPTPS手部畸形。根据文献和UCSC人类基因组数据库选择遗传标记进行连锁分析和单倍型分析，首次在中国人家系中确认了TPTPS致病基因定位于染色体7q36。在家系1(18名家系成员，7名患者)中进行两点连锁分析，当θ=0时遗传标记P384获得最大Lod值为3.72，肯定连锁。该家系中遗传标记D7S3037与其端粒侧临近标记之间发生一次重组事件，表明TPTPS致病突变位于SHH基因端粒侧。家系2(8名家系成员，3名患者)中，患者共享染色体7q36区域遗传标记的单体型，提示致病突变定位于同一染色体区域。为寻找致病突变，我们根据定位的候选区域内基因信息，直接针对两个中国人TPTPS家系患者进行了候选区域基因LMBR1／C7ORF2、HLXB9、RNF32、NOM1、C7ORF13、LOC389602、LOC393076、LOC393889和LOC393890外显子及两侧部分内含子区域的直接测序研究，结果没有发现相应的致病性序列改变。应用VISTA软件对人类、小鼠和非洲爪蟾的非编码序列进行了同源性比对，在PPD／TPT候选区域内选择10个高度保守的调控序列区域(包括ZRS)，直接在TPTPS患者中进行了测序检测，结果亦未见突变。此外，我们还在两个PPD／TPT家系中进行了ZRS突变检测和初步功能研究。在其中一个墨西哥人PPD／TPT家系中，发现一个ZRS-402处C＞T的点突变。ZRS-402处C高度保守，在各种已知物种中都为C。在墨西哥人群随机筛查118条染色体未见该点突变出现于正常人群，提示这是一个导致PPD／TPT表型的新的ZRS突变。在另外一个中国人PPD／TPT家系中未发现ZRS的突变。进一步应用斑马鱼(zebrafish)增强子-GFP-Tol转座子表达系统对新发现的人类ZRS突变进行斑马鱼体内表达研究。结果显示，GFP报告基因从受精后30小时(hourspost-fertilization，hpf)开始在心脏中有特异性表达，从100hp研始在鱼鳍中有特异性表达。正常ZRS载体与ZRS-402突变载体的表达未见有明显差异。还需要进一步的表达和交配实验来验证ZRS在鱼鳍发育中的作用。总之，我们通过上述研究，在中国人家系中确认了TPTPS致病基因的染色体定位并首次排除了SHH基因；证明了TPTPS致病突变不同于PPD／TPT，不位于ZRS；在墨西哥人PPD／TPT家系中发现一个新的ZRS点突变。成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor，FGFR)作为单次跨膜受体酪氨酸激酶家族共包括四名成员，即FGFR1-4，其中FGFR1-3与人类多种先天性发育异常密切相关。在FGFR1蛋白的第252位氨基酸，FGFR2蛋白的253位氨基酸和FGFR3蛋白的第250位氨基酸都是脯氨酸(Pro或P)，FGFR1基因P252R、FGFR2基因P253R和FGFR3基因P250R三种功能获得性(gain-of-function)突变分别是Ⅰ型Pfeiffer、Apert和Muenke等与颅缝早闭(craniosynostosis)表型有关的综合征的致病原因。Apert综合征是最严重的颅缝早闭综合征之一，主要表现为颅缝早闭和肢端发育畸形。三分之二的Apert综合征是由FGFR2基因的S252W突变引起，表现为更为严重的颅面部畸形。而另外三分之一由P253R突变引起，可能表现为更严重的并指畸形。有关Fgfr2-S252W突变的转基因小鼠已经建立两个品系。这两种S252W转基因小鼠的许多表型都与人类Apert综合征相似，但是肢端表型异常轻微，没有发现并指畸形。根据人类FGFR2基因的P253R突变引发肢端表型更为严重的事实，我们通过基因打靶技术建立携带Fgfr2基因的P253R点突变转基因小鼠，希望通过对这个转基因小鼠表型的分析来确定Fgfr2基因在肢端发育中的作用。我们针对不同发育阶段(E15.5-P10)的Fgfr2+／P253R转基因小鼠进行了初步的表型分析，结果显示，携带突变的小鼠表现出冠状颅缝早闭、脑积水、腭部不完全愈合和长骨等器官的发育异常。除了不具备并指表型外，与人类Apert综合征的表型基本相似。可以初步认为这是一个Fgfr2基因P253R突变导致的Apert综合征小鼠模型。有关携带相应突变的Knock-in小鼠模型还未见报道。FGFR3基因作为负性调控因子在骨骼发育过程中具有重要的作用。该基因P250R突变除了导致Muenke综合征发生之外，还可以引发其他多种综合征的临床表型，其中包括Saethre-Chotzen综合征、Crouzon综合征、Pfeiffer综合征、Beare-Stevenson综合征和颅缝早闭伴耳聋或单纯性耳聋等。这提示我们不同的遗传背景对FGFR3基因P250R突变的影响是不同的。我们将小鼠Fgfr3基因外显子3-13(约12.0kb)序列克隆到pBluescript SK载体中，在外显子7中定点突变引入了726 731CC＞AG碱基替换，从而产生了与人类FGFR3基因P250R相同源的小鼠Fgfr3基因P244R突变。应用分子克隆技术先后将TK基因插入到5′端的SpeⅠ位点，将两端含有loxP识别位点的neo基因插入到内含子7中，转录方向与目的基因Fgfr3相反，最终得到长度为17.0kb的载体，测序后经SacⅡ酶切进行DNA线性化。使用电穿孔技术将打靶载体引入G4-ES细胞中。经过Southern杂交鉴定，聚合实验以及胚胎移植手术，初步得到了携带有Fgfr3基因P244R突变的嵌合体小鼠。有关携带相应突变的小鼠模型还未见报道。本研究为揭示不同遗传背景和修饰基因对疾病表型的作用提供了动物模型。