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肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球范围内癌症相关死亡的常见原因。跨核膜抗氧化转录因子Nrf1(nuclear factor-erythroid 2 p45 submit-related factor 1)是Cnc-bZIP(cap‘n’collar basic-region leucine zipper)即Cnc碱性亮氨酸拉链亚家族成员之一,通过调控下游抗氧化酶、解毒酶、26s蛋白酶体亚基基因的转录,保护细胞和组织免受氧化应激的影响,引发细胞进行适应性变化以维持机体内平衡。研究证实在成年小鼠肝脏特异敲除Nrf1会诱发肝细胞癌[1,2]。O连接的N-乙酰葡萄糖胺(O-linked N-acetylglucosamine,O-GlcNAc)单糖修饰是细胞为满足不同生物学功能需要,进行的快速、可逆、动态的蛋白质翻译后修饰,由体内的唯一的O-GlcNAc糖基转移酶(O-GlcNAc Transferase,OGT)催化进行。O-GlcNAc修饰的异常与肿瘤发生、迁移和侵袭过程密切相关,在肝细胞癌形成和发展中起着重要作用[3]。近期液相色谱-光谱法检测提示,OGT可以与Nrf1蛋白相互作用,因此,探讨糖蛋白Nrf1和O-GlcNAc修饰的关系,以及O-GlcNAc修饰对Nrf1生物学功能及Nrf1在肝细胞癌发生发展中作用的影响,将为Nrf1缺失诱发HCC发病机理、临床病理联系及预后判断提供新的思路。研究方法与结果:①敲减hNrf1/TCF11对人肝癌细胞生物学行为的影响我们首先用Western Blot检测hNrf1/TCF11在人正常肝细胞HL-7702及不同肝癌细胞系中的表达,发现hNrf1/TCF11在人正常肝细胞HL-7702中高表达,而在不同肝癌细胞系中hNrf1/TCF11的表达较低。接下来构建hNrf1/TCF11-shRNA慢病毒载体,筛选出沉默hNrf1/TCF11最有效的shRNA靶序列为:ACAACCTGAGG AATACCTT。利用构建好的hNrf1/TCF11-shRNA慢病毒载体及Negative control shRNA空载质粒病毒载体转染人肝癌细胞系HepG2、MHCC97H、MHCC97L,建立稳定敲减hNrf1/TCF11细胞系,分别命名为shNrf1实验组和shNC阴性对照组。MTT、细胞克隆形成实验观测细胞增殖情况,结果均显示在HepG2细胞中敲减hNrf1可促进细胞增殖,而在另外两株肝癌细胞shNrf1-MHCC97H、shNrf1-MHCC97L与对照株shNC间无明显差异。流式细胞技术测定各组细胞的细胞周期及凋亡,结果提示,实验组(shNrf1)细胞出现了G2/M期停滞,而仅在HepG2细胞敲减hNrf1后细胞早期凋亡率明显增加(p<0.05),而在其他两株肝癌细胞中未见明显变化。最后我们用细胞划痕体外迁移实验及Transwell侵袭实验观察细胞运动能力,结果显示在hepg2、mhcc97h、mhcc97l中敲减hnrf1(shnrf1-)后迁移及侵袭能力均较对照组(shnc-)明显增强(p<0.05)。②敲减hnrf1/tcf11对肝癌细胞迁移、侵袭影响的机制研究用real-timepcr检测shnrf1-hepg2中与肿瘤转移相关基因的表达,发现mmp-2、mmp-9表达显著升高,cdh1表达显著下调(p<0.05)。westernblot检测各株shnrf1实验组和shnc阴性对照组细胞e-cadherin、vimentin及mmp-9的表达量,结果再次证实敲减hnrf1/tcf11使肝癌细胞发生了上皮间质转化(emt)。对shnrf1-hepg2细胞进行表达谱测序,结果进行信号通路聚类分析发现,有效敲减hnrf1后hepg2细胞?-catenin通路被激活。top/fopflash实验显示,沉默hnrf1能显著激活β-catenin的转录活性(p<0.01),westernblot检测发现敲减hnrf1时?-catenin及其调控的下游靶基因cyclind1、c-myc、mmp-7蛋白表达均增加。放线菌酮蛋白追踪实验发现,与shnc-hepg2组相比shnrf1-hepg2细胞内?-catenin半寿期延长,蛋白稳定性增加。westernblot检测细胞浆和细胞核内?-catenin的表达情况发现,敲减hnrf1时细胞浆和细胞核内活化的?-catenin累积,而且易位入核的活性?-catenin增加,而胞核内易被降解的磷酸化的?-catenin明显减少。coip实验发现过表达hnrf1时,?-catenin的泛素化降解增强。最后通过建立裸鼠人肝癌肺转移瘤模型,在体内进一步验证hnrf1/tcf11对人肝癌细胞生物学行为的影响。结果发现shnrf1组肺表面转移结节数量、结节体积均明显大于shnc组。免疫组化染色法检测模型鼠中肝脏?-catenin的表达,结果shnrf1实验组hnrf1/tcf11表达减少而?-catenin累积增加。肺部转移瘤中shnrf1组?-catenin及其下游基因cyclind1的蛋白表达量较shnc组明显增高。real-timepcr、westernblot检测两组模型鼠肝脏hnrf1/tcf11、e-cadherin、?-catenin及其下游基因cyclind1、c-myc、mmp7表达,结果shnrf1实验组hnrf1/tcf11表达减少,e-cadherinmrna水平变化不明显,但蛋白表达显著下调,?-catenin及其下游基因cyclind1、c-myc、mmp7表达均不同程度增加。③o-glcnac修饰对nrf1的影响westernblot检测hek293t细胞在不同培养条件下细胞内o-glcnac水平及hnrf1/tcf11的丰度。结果显示,在低糖培养基(g5)中加入ogt特异抑制剂alloxan(100?m),细胞内o-glcnac水平显著下降,hnrf1/tcf11丰度显著增加;相反高糖培养基(g25)中加入oga抑制剂pugnac(50?m),细胞内o-glcnac水平提高,hnrf1/tcf11丰度下降。gst-pulldown、coip实验证实ogt与nrf1在体外、细胞内均能相互作用,并且两者在细胞内的相互作用受glcnh2影响。合成siRNA并经real-time PCR、Western blot验证筛选出能有效干涉OGT表达的siOGT-1序列为:sense 5’-GGAGCCUUGCAGUGUUAUA-3’,Anti-sense5’-UAUAACACUGCAAGGCUCC-3’,ARE-荧光素酶报告基因检测显示,干涉OGT时Nrf1的转录活性增强。Western blot分析显示siOGT-1敲减OGT时,内源性的Nrf1及其下游靶基因Lipin1和GCLM的蛋白表达均有明显增加。相反,过表达OGT蛋白时,细胞内由OGT催化的总的O-GlcNAc修饰蛋白较对照组细胞表达增加而内源性的Nrf1蛋白表达减少,Nrf1调控下游靶基因的转录活性减弱。co IP实验表明过表达OGT时能增加Nrf1的泛素化,同时在G25培养条件下过表达OGT,能增加底物Nrf1降解;相反在低糖培养基(G5)中过表达OGT,细胞内的Nrf1的降解减少,此时Nrf1的表达量明显高于高糖时。而当转染Nrf1、OGT(ΔTPR1-6)时Nrf1的表达量明显高于共转染Nrf1、OGT组。放线菌酮追踪实验显示在干涉OGT时,Nrf1蛋白稳定性增强。最后我们用Nrf1不同截短体与OGT共转染,Western blot分析显示Nrf1进行O-GlcNAc修饰的区域位于PEST2序列富含丝氨酸的区段。结论:①在人肝癌细胞系HepG2、MHCC97H、MHCC97L成功建立稳定敲减hNrf1/TCF11的shNrf1实验组和shNC阴性对照组细胞株。②hNrf1/TCF11基因对人肝细胞癌生物学行为的调控主要表现在敲减hNrf1/TCF11时肝癌细胞迁移和侵袭能力增强。③敲减hNrf1/TCF11时?-Catenin通路激活。通过减少?-Catenin磷酸化依赖的泛素化降解,使细胞内激活的?-Catenin大量累积并易位入核,启动下游靶基因的表达,从而促进肝癌细胞迁移和侵袭。④OGT能与Nrf1相互作用,在Nrf1 PEST2序列富含丝氨酸的区段催化Nrf1的O-Glc NAc修饰,来调节Nrf1 O-糖基化依赖的泛素化降解,以适应细胞在不同条件对Nrf1的需求。