[背景与目的]：中国云南省宣威地区是世界肺癌发病率最高的地区之一,女性肺癌发病率是中国其他地方的20倍。前期研究认为,这种高肺癌发病率与吸烟和工业污染等因素相关不明显,而与当地出产和使用的C1烟煤燃烧产物中含有的二氧化硅颗粒物有关。但是,之前的研究没有对C1烟煤燃烧产物中的二氧化硅进行定量,没有对燃烧产物中的二氧化硅颗粒物进行分离,这些二氧化硅颗粒物的粒径分布、表面特征和显微组份的依存关系是决定颗粒物对肺损伤的关键因素。另外,国际癌症研究机构己将结晶型二氧化硅规定为人类第一类致癌物质,是因吸入肺部后导致肺纤维化而诱发癌症。但是,这种自然产出的二氧化硅颗粒物吸入肺部后导致肺损伤甚至是肺癌的机制目前尚不清楚。我们模拟宣威地区女性人群暴露二氧化硅颗粒物的自然情况,进行长时间-低浓度经气管滴注工业合成的纳米二氧化硅颗粒物的大鼠诱癌试验,发现炎症反应是导致肺损伤的主要因素。但是,从炎症反应到癌症发生的分子生物学机制目前尚不清楚。最近的研究发现,一种非编码的小RNA (microRNA,miRNA)可能在炎症反应和癌症发生之间起“桥梁”作用。也就是炎症反应产生的炎性细胞因子能刺激miRNA表达水平升高,miRNA表达水平升高可通过扩大炎症效应而促进肿瘤发生。本研究的目的在于：(1)物理法从C1烟煤燃烧产物中分离二氧化硅颗粒物,研究这种自然产出的二氧化硅颗粒物在形貌特征,粒径分布和表面特征上与工业合成的二氧化硅和结晶型二氧化硅颗粒物有何差异；(2)模拟燃烧试验,间接法计算宣威地区农村女性人群从室内空气中吸入二氧化硅颗粒物的日暴露量均值,为体外细胞试验和动物试验提供实验依据；(3)通过基因芯片技术筛选与宣威地区非吸烟女性肺癌发生相关的miRNAs;(4)研究从C1烟煤燃烧产物中分离出的二氧化硅颗粒物对支气管上皮细胞炎性细胞因子分泌和miRNA表达的影响。初步探索自然产出的二氧化硅颗粒物可能的致癌机制。[方法]：(1)选取宣威肺癌高发区开采和使用的C1烟煤20份,以肺癌中等高发区开采和使用的烟煤(C2+1,K7)和肺癌低发区使用的烟煤(M30)为对照。从昆明医科大学第三附属医院病理科调取来自宣威地区(当地出生并居住生活3代以上)的非吸烟非小细胞女性肺癌患者术后病理组织标本20份。采用氟硅酸钾容量滴定法测量原煤和灰化后底灰中的二氧化硅含量,扫描电镜观察原煤和底灰中的二氧化硅颗粒物形貌,扫描电镜能谱分析二氧化硅颗粒物显微组份的依存关系,透射电镜观察单颗粒形貌。模拟当地用煤习惯和用煤量进行燃烧试验,空气污染监测仪收集煤烟尘,物理法从底灰和煤烟尘中分离二氧化硅颗粒物,激光粒度分析仪分析颗粒物的粒径分布,BET氮吸附比表面积仪测量颗粒物的比表面积。间接法计算宣威地区农村女性人群在使用C1烟煤时从室内空气中吸入二氧化硅颗粒物的日暴露量均值：(2)从昆明医科大学第三附属医院病理科调取来自宣威肺癌高发区的非吸烟非小细胞女性肺癌组织和对应非癌肺组织标本2对,基因芯片技术筛选癌组织中相对于非癌肺组织中差异表达的miRNAs和mRNAs, real time PCR技术对上调或下调最显著的miRNAs在20例来自宣威地区的非吸烟非小细胞女性肺癌组织中的表达量进行验证,生物信息遗传学预测上调最显著的miRNAs调控的靶基因。对癌组织中差异表达的1mRNAs进行基因功能富集分析；(3)体外细胞试验,以质量浓度和表面积浓度为衡量标准,台盼蓝抗法检测不同浓度刺激48h后支气管上皮细胞成活率变化,透射电镜观察100μg/mL二氧化硅颗粒物刺激支气管上皮细胞24h后,二氧化硅颗粒物在支气管上皮细胞内的亚细胞分布。根据细胞成活率试验和透射电镜观察结果,酶联免疫吸附法(ELISA)检测100μg/mL的二氧化硅颗粒物刺激支气管上皮细胞24h、48h后白介素8(IL-8)、γ干扰素(γ-IFN)、碱性成纤维细胞生长因子和成纤维细胞生长因子-2(bFGF/FGF-2)和血管内皮生长因子(VEGF)等细胞因子分泌变化,real time-PCR技术检测各时间点的miRNAs表达量变化。Pearson相关分析细胞因子分泌与miRNAs表达变化之间的关系。l结果1：(1)宣威肺癌高发区普遍使用的C1烟煤、煤燃烧产物中的二氧化硅含量显著高于肺癌低发区使用的M30烟煤和肺癌中等高发区使用的C2+1和K7烟煤(P<0.05)。各烟煤原煤中未发现游离的二氧化硅晶体,但可在C1烟煤燃烧产物(底灰和煤烟尘)中观察到二氧化硅晶体存在,同时在来自宣威肺癌高发区的女性肺癌癌组织中发现二氧化硅晶体存在。物理法可从C1烟煤燃烧产物中分离出二氧化硅颗粒物,这种自然产出的二氧化硅颗粒物形态不规整,表面不光滑,粒径分布多为纳米级,赋存有铝、钙、铁和锰元素。间接法测得宣威地区女性人群从室内空气中吸入二氧化硅颗粒物的日暴露量均值为2.25+0.35μg；(2)基因芯片分析结果显示,宣威地区非吸烟女性肺癌癌组织中有459个miRNAs表达水平相对于对应非癌肺组织中的表达水平显著不同,其中251个miRNAs显著上调(≥2倍),208个miRNAs显著下调(≥2倍)。其中miR-508-5P、miR1270和miR-501-5P上调最显著,miR-24-3P和miR-103a-3P下调最显著。通过real-time-PCR技术验证,miR-508-5P、miR1270和miR-501-5P在20例来自宣威地区的非吸烟女性肺癌癌组织中稳定高表达(P<0.05),而miR-24-3P和miR-103a-3P在癌组织中稳定低表达(P<0.05)。生物信息遗传学预测显著上调的miRNAs调控的靶基因多数与炎症应答有关。同时用基因芯片技术分析了27958个mRNAs,发现在宣威女性肺癌癌组织中有4263个基因显著上调,1922个基因显著下调,对差异表达基因进行基因功能聚类分析,参与免疫炎症应答的基因占79.4%；(3)和50-nm和结晶型二氧化硅颗粒物相比,C1烟煤燃烧产生的煤烟尘中分离出的二氧化硅颗粒物对支气管上皮细胞的成活率影响最大,透射电镜观察发现,这种自然产出的二氧化硅颗粒物更易穿透支气管上皮细胞膜而进入细胞内,所有的二氧化硅颗粒物均不能进入细胞核。自然产出的二氧化硅颗粒物和50-nm的二氧化硅颗粒物主要刺激支气管上皮细胞分泌IL-8和γ-IFN,而结晶型二氧化硅颗粒物主要刺激支气管上皮细胞分泌bFGF/FGF-2和VEGF。经100μg/mL自然产出的二氧化硅颗粒物刺激支气管上皮细胞24h后,miR-508-5P、miR1270和miR-501-5P的表达量与空白组相比分别上升了5、7和6倍。刺激48h后分别上升了7.5、10和10倍,显著高于50-nm二氧化硅组和结晶型二氧化硅组(P<0.0)。real-timePCR测定3个miRNAs共同调控靶基因PIK3AP的表达量,发现在自然产出的二氧化硅刺激组中显著低表达(P<001)。Pearson相关分析发现,刺激24h后,IL-8和y-IFN分泌量与3个miRNAs表达量之间的关联性为0.925和0.948, bFGF/FGF-2和VEGF分泌量与3个miRNAs表达量之间的关联性为-0.947和-0.964,刺激48h后,IL-8和y-IFN分泌量与3个1miRNAs表达量之间的关联性为0.978和0.933。bFGF/FGF-2和VEGF分泌量与3个]niRNAs表达量之间的关联性为-0.630和-0.732。[结论]：(1)宣威地区富含二氧化硅的C1烟煤与肺癌死亡率空间分布上高度吻合,燃烧产物和肺组织中均有二氧化硅颗粒物富集,颗粒物形态和显微组份上具有继承性。宣威地区C1烟煤中自然产出的纳米二氧化硅颗粒物存在“C1烟煤燃烧→烟煤中含有的纳米级二氧化硅颗粒物进入室内空气中→随空气悬浮颗粒物吸入肺内并沉积”的富集迁移路线；(2)宣威地区农村非吸烟女性肺癌可能是长时间-低浓度暴露燃煤中自然产出的二氧化硅颗粒物的结果；(3)宣威地区农村非吸烟女性肺癌人群可能存在：长时间-低浓度吸入燃煤中自然产出的二氧化硅颗粒物→肺部慢性非特异性炎症反应→炎性细胞因子大量释放→炎性细胞因子刺激多个miRNAs表达量上升→肺癌发生的致病途径。