研究背景及目的：　　鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,Ab)是医院感染重要病原菌，属机会致病菌，黏附性强是其主要特点，一旦定植难以清除。Ab定植和感染的主要部位是人体呼吸道，与上皮细胞的黏附是第一步，因此对其在呼吸道上皮细胞的黏附开展深入研究有助于临床防治其感染。目前用于研究呼吸道上皮细胞与细菌黏附的体外模型通常采用24孔培养板模型，该模型虽操作简便，但存在培养环境封闭、不能模拟体内动态环境和无法实时观察等局限性。因此我们需建立一种能模拟体内动态环境，并且可方便实时观察的体外研究模型。　　流动小室(flow-chamber)是常用于体外观察和定量细菌生物膜(bacterial biofilm)形成的经典模型，与培养板模型相比，其结构开放并能动态观察，同时可避免细菌由于重力作用沉积对细菌生物膜的影响。目前尚未见其用于研究细菌在宿主细胞上的黏附，本研究拟通过在流动小室底部培养呼吸道上皮细胞，构建可用于研究细菌在宿主细胞上黏附的体外模型。　　该模型有望用于研究抗菌药物对细菌黏附行为影响的重要科学问题，既往的研究表明，亚抑菌浓度(sub-minimalinhibitory concentration,sub-MIC)抗菌药物可影响Ab的黏附行为，进而影响细菌的定植和感染的发生，最终影响感染的转归与结局。因此本研究将已建立的流动小室体外研究模型，初步评价亚-MIC抗菌药物对临床耐药Ab在呼吸道上皮黏附的影响，为进一步研究在感染治疗过程中细菌对细胞黏附的机制奠定基础。　　研究目的：　　建立能模拟体内环境、用于细菌与宿主细胞黏附研究的体外模型；将该模型初步应用于亚-MIC抗菌药物对Ab黏附呼吸道上皮细胞的影响。　　研究方法：　　第一部分 体外呼吸道上皮细胞细菌黏附模型的建立　　1.流动小室模型的构建　　模型的建立以人呼吸道上皮细胞（HBE）、鲍曼不动杆菌（ATCC17978）标准菌株为研究对象，以流动小室为研究载体，通过在其底部培养一层HBE细胞，给以一定的接种细菌并静置1h后，接入流动系统，启动蠕动泵使培养液从供液瓶流出，流经气泡捕捉器和流动小室，最终流入收集瓶内，构建用于流动状态下细菌在细胞上初始黏附的体外模型。　　2.HBE细胞培养参数的确定　　HBE细胞培养参数分为两个部分进行确定：（1）静止状态。HBE细胞在静止状态下培养，参数包括培养液中血清的浓度、细胞培养温度、细胞培养时间和细胞的接种密度，以生长曲线确定HBE细胞在流动小室底部的生长周期；（2）流动状态。系统流动状态是实验研究的关键，以接入流动系统后HBE细胞的稳定性确定流动参数，其中流动相的流动时长和流速为考察的重要参数。　　3.流动系统参数的优化　　正交试验设计以贴壁细胞数量为指标，标准菌株ATCC17978在HBE上的黏附为研究对象，采用L9（34）正交试验对模型的重要参数流速、流动时间和流动相组分进行优化，确定流动小室中贴壁细胞数量最佳时的条件。　　4.模型中Ab在HBE细胞上黏附的观察和定量　　(1)荧光显微镜观察和定量　　采用SYTO9荧光标记ATCC17978，接入流动系统，流动1h后以荧光显微镜对细菌在宿主细胞上的黏附进行实时观察；获取图片后，采用ImageJ软件计算荧光强度，半定量HBE细胞上黏附的细菌数量。　　(2)平板菌落计数法定量Ab在HBE细胞上的黏附　　ATCC17978以2×108、108、5×107、2.5×107 CFU/ml接种量接种，接入流动系统1 h 后收集细胞，用细胞裂解液（0.25％胰酶和 0.2％ TritonX-100 等体积混合）200 μl处理细胞5 min，收集裂解液，稀释后涂布营养琼脂平板。　　同时以培养板黏附模型作对照，其方法为 24 孔培养板中铺满 HBE 细胞， ATCC17978以2×108、108、5×107、2.5×107 CFU/ml接种量接种，静止孵育1 h，使用细胞裂解液200μl处理细胞5 min，收集裂解液，稀释后涂布营养琼脂平板，计数。　　5. 模型中细胞免疫因子的检测　　实验组：将ATCC17978以2×108 CFU/ml的接种量感染流动小室内HBE细胞，静置1 h后接入流动系统，分别于流动30 min、60 min、90 min和120 min收集小室上清，以ELISA试剂盒对上清液中免疫因子TNF-α、IL-6和IL-8进行定量检测；以不接种细菌作为空白组。　　同时设置传统培养板模型作对照，相同处理方法，相同时间点测定 TNF-α、IL-6和IL-8。　　6. A549细胞和PAO1分别应用于该模型的适应性初步验证　　以A549细胞应用于该模型建立，同样的最优参数和实验方法与Ab进行黏附实验；以铜绿假单胞菌PAO1应用于该模型，于同样的最优参数和实验方法与HBE进行黏附实验；以荧光显微镜法观察和平板菌落计数法对黏附细菌数量定量，以初步验证本模型的适应性。　　第二部分 流动小室模型应用于亚-MIC抗菌药物的研究　　1.药敏试验确定实验菌株　　收集来自呼吸道感染病人痰液的 12 株耐药 Ab，采用倍比稀释琼脂平板法测定MIC值。按CLSI标准(2016年版)判定耐药折点。选择耐药性最高的菌株用于后续实验。　　2. 实验药物亚-MIC的确定　　选取亚胺培南(IMP)、替加环素(TGC)、头孢哌酮(CFP)和阿米卡星(AMK)四种临床常用抗菌药物，以测定1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC和1/16 MIC的生长曲线确定亚-MIC。　　3.亚-MIC抗菌药物对实验菌株黏附HBE细胞的影响　　菌株的药物预处理：实验分为药物处理组和对照组；实验菌株分别于亚-MIC（1/4 MIC 1/8MIC和1/16MIC）IMP、AMK、CFP、TGC药物的LB培养基中共培养8 h 后，离心去除药物，作为药物处理组；实验菌株于未加药的空白 LB 培养基中作用同样时间，作为对照组。流动小室中，实验菌株与HBE细胞进行黏附实验后，采用以下方法进行测定：　　(1)荧光显微镜法观察和定量实验菌株在HBE细胞上的黏附　　以 SYTO9 荧光标记实验菌株，采用荧光显微镜法观察处理组和对照组的实验菌株在HBE细胞上的黏附；采集图片后使用ImageJ软件计算其荧光强度，作为细菌黏附的半定量分析。　　(2)平板菌落计数法定量实验菌株在HBE细胞上的黏附　　以平板菌落计数法定量处理组和对照组的实验菌株黏附于HBE的数量。同时，设置传统培养板模型，定量各处理组实验菌株在该模型内HBE细胞上的黏附。　　4. Ab黏附HBE细胞后细胞免疫因子的改变　　实验分为实验组、空白组和对照组；实验组为 Ab 经药物预处理，方法和浓度分组同黏附实验所述；空白组为未加Ab处理；对照组为Ab未经药处理。以2×108 CFU/ml的接种量接种Ab，接入流动系统60 min、120 min和240 min后收集细胞上清液，以ELISA法检测上清中细胞因子TNF-α、IL-6和IL-8。　　主要研究结果：　　第一部分 体外呼吸道上皮细胞细菌黏附模型的建立　　1.流动小室模型的构建　　按照模型结构示意图（图2-1），成功构建流动状态下细菌在细胞上初始黏附的研究模型。　　2.HBE细胞培养参数的确定　　(1)采用含20％小牛血清的RPMI-1640培养液37 ℃培养， 24 h后细胞处生长对数期末，显微镜下察见有超过90％细胞发生融合，该阶段细胞生长数量趋于稳定，可满足后续黏附实验需要，因此选取培养24 h细胞用于实验。　　(2)接入流动系统后，显微镜观察发现流动时长＞4 h，流速大于75μl/min时细胞稳定性改变（形态学改变和数量减少），因此确定4 h和75μl/min为实验研究最长时间和最大流速。　　3.模型流动系统最优参数的确定　　正交试验确定最优的流动参数如下：流速 50 μl/min，流动时长 1 h，流动相为RPMI-1640+2mM L-glutamine+2.5％FBS。　　4. 模型中Ab在HBE细胞上黏附的观察和定量　　(1)荧光显微镜实时定量观察黏附细菌　　SYTO9荧光标记细菌的方法可较清晰地标记细菌在宿主细胞上的黏附，随着细菌接种量增大，荧光强度增强，黏附细菌可实时观察和半定量分析。　　(2)平板菌落计数法定量细菌黏附　　流动小室法和培养板法均表明，细菌黏附量与细菌接种量呈现正相关。相同的接种密度（2×108CFU/ml）下，培养板模型的细菌黏附数量(6.12±0.51)×105 CFU 显著高于流动小室模型(4.63±0.32)×105 CFU，(P＜0.05)，提示静止状态下细菌在细胞的黏附出现“假阳性”。　　5.细菌黏附后宿主细胞免疫因子的改变　　(1) ELISA定量结果显示，流动小室模型流动120 min后， TNF-α、IL-6和IL-8水平显著升高。(2) 传统培养板模型在90 min时，检测出TNF-α、IL-6和IL-8水平开始显著升高；提示在环境封闭的培养板模型中细胞因子水平的显著升高较流动小室模型提前。　　6. A549细胞和PAO1分别应用于该模型的适应性初步验证　　(1) 以A549细胞系对模型适应性初步验证，Ab黏附的荧光显微镜观察结果为：细菌接种量增加荧光强度增强；平板菌落计数定量Ab黏附的结果为：Ab接种量增加，细菌黏附数量增加，呈正相关；提示该模型在相同培养条件和最优参数下对 A549 细胞适应性较好。　　(2) 以PAO1为黏附细菌对模型适应性初步验证，荧光显微镜观察结果为：PAO1接种量增加荧光强度增强；平板菌落计数定量 PAO1 黏附结果为：PAO1 黏附数量随接种量增加而增大；提示该模型在相同培养条件和最优参数下对PAO1菌种适应性良好。　　第二部分 流动小室模型应用于亚-MIC抗菌药物的研究　　1.实验菌株的选择　　根据12株临床分离Ab的MIC测定结果，挑选出耐药程度较高的Ab276临床菌株作为后续研究的实验株。　　2.实验药物亚-MIC的确定　　根据生长曲线数据分析，AMK、IMP、TGC和CFP 1/4MIC及以下浓度不影响Ab276生长，因此拟选取1/4MIC、1/8 MIC和1/16MIC作为试药浓度用于观察或定量研究。　　3. 亚-MIC抗菌药物对Ab276黏附HBE细胞的影响　　(1)荧光显微镜法观察和定量Ab276在HBE细胞上的黏附　　流动小室模型的荧光观察和半定量分析结果显示：与对照组相比，1/4 MIC AMK处理组荧光强度明显减弱，提示1/4MIC AMK可抑制Ab在HBE细胞的黏附；而1/4 MICIMP处理组较对照组荧光强度明显增强，提示1/4MIC IMP可增强Ab在HBE细胞的黏附；1/4 MIC CFP和TGC对Ab在HBE细胞的黏附无影响。　　(2)平板菌落计数法定量Ab276在HBE细胞上的黏附　　流动小室模型平板菌落计数结果为：经1/4MIC、1/8 MIC和1/16MIC的IMP、AMK、CFP和TGC处理Ab276后，1/4MIC、1/8MIC IMP显著增强Ab276黏附HBE细胞的作用，处理组黏附数(10.07±0.60)×105 CFU、(7.64±0.54)×105 CFU和对照组黏附数(4.75±0.71)×105CFU，差异有统计学意义(P＜0.05)，1/16MIC IMP则无显著影响；1/4MIC、1/8 MIC AMK显著抑制其在HBE细胞的黏附，处理组黏附数分别为(1.89±0.27)×105 CFU、(2.92±0.25)×105 CFU，对照组黏附数为(4.75±0.69)×105 CFU，差异有统计学意义(P＜0.05)，1/16MIC AMK则无显著影响；1/4MIC、1/8 MIC和1/16 MIC CFP和TGC对Ab276黏附HBE细胞无显著影响。　　培养板黏附模型平板菌落计数结果为：1/4MIC IMP可增强Ab276于HBE细胞的黏附，(10.05±0.92)×105CFU和(6.58±0.57)×105CFU，(P＜0.05)，1/8 MIC和1/16MIC IMP则无显著影响；1/4MIC AMK可显著抑制Ab276于HBE细胞的黏附，处理组和对照组分别为(4.39±0.51)×105CFU和(6.58±0.57)×105CFU，(P＜0.05)，1/8 MIC和1/16MIC AMK则无显著影响；1/4MIC、1/8MIC和1/16MIC CFP和TGC则对Ab276黏附HBE细胞无显著影响。　　4. Ab276黏附HBE细胞后细胞免疫因子的改变　　(1)流动240 min后，模型内AMK（1/4 MIC）实验组免疫因子TNF-α、IL-6和IL-8水平较对照组显著降低，实验组分别为(20.85±1.66) pg/ml，(12.57±1.18) pg/ml和(22.84±2.26) pg/ml，对照组分别为(29.52±1.67) pg/ml，(18.70±1.57) pg/ml和(33.50±2.28) pg/ml，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　(2)流动240 min后，模型内IMP（1/4 MIC）处理组TNF-α水平实验组(42.97±2.74) pg/ml 较对照组(29.52±1.67) pg/ml 显著升高(P＜0.05)；IL-6 水平实验组(26.94±2.42) pg/ml较对照组(18.70±1.57) pg/ml显著升高 (P＜0.05)。　　(3)1/4MIC CFP和TGC处理Ab276后，对HBE细胞免疫因子的释放无显著影响。　　结论：　　1.本研究在流动小室模型中进行宿主细胞培养，首次成功构建可模拟体内开放环境，用于研究细菌黏附于宿主细胞的体外研究模型，并确定了Ab与HBE细胞黏附研究的最优模型参数。　　2.细菌黏附量和宿主细胞因子测定结果均提示，流动小室模型避免了传统模型（培养板黏附模型）因细菌和细胞因子在局部封闭环境中“累积”对细胞的作用，而更接近体内真实情况，且该模型的构建参数对其他宿主细胞和菌种也有较好的适应性。　　3. AMK（1/4 MIC）对Ab在HBE细胞上的黏附具有显著抑制作用，且显著抑制宿主细胞因子的释放，IMP（1/4 MIC）则显示了诱导Ab黏附并促进宿主细胞炎症的发生。该结果提示，药物对Ab在宿主细胞上黏附的影响呈现药物特异性，且抗菌药物对Ab的黏附行为与细胞免疫相关，该现象提示细菌对宿主细胞黏附作用的改变可直接影响感染初始的细胞免疫，亚-MIC药物干预Ab与宿主细胞黏附具有潜在的应用价值，但其深入的影响机制还需更进一步的研究。