中风,即脑卒中,排在心脏病和癌症之后,是世界第三大死亡原因,其中缺血性中风占87%。除了死亡,绝大多数中风幸存者出现了不同程度的永久性残疾,给患者家庭和社会带来了极大的负担和痛苦。缺血性中风也称缺血性脑卒中或缺血性脑损伤,其造成脑损伤区域的大小和程度主要取决于具体闭塞的脑动脉。脑动脉发生闭塞后,神经内分泌激素和促炎介质的级联反应,先后造成多种炎症细胞和免疫细胞向缺血区域内浸润并聚积,进而产生不同程度的神经炎症。目前认为,尽管具体的分子机制尚不完全清楚,神经炎症的进程可直接影响中风患者的大脑损伤程度及其愈后的临床表现。大脑主要由皮质神经元细胞和神经胶质细胞构成,其中神经胶质细胞包括星型胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞,各种细胞在大脑的不同区域各司其职。无论是正常生长发育或新陈代谢,还是发生特殊病理事件,细胞间的交互通讯都起着至关重要的作用。细胞间通讯主要由细胞直接接触和细胞外囊泡介导。外泌体是最重要的细胞外囊泡,直径为30-150 nm,由细胞膜衍生的微泡样结构。细胞外囊泡主要包括外泌体和微泡,作为细胞间通讯的重要媒介,广泛参与原核生物和高等真核生物细胞间的信号传递,并调节多种生物过程。二十年来,细胞外囊泡在包括癌症、传染病和神经退行性疾病在内的疾病中的病理生理作用逐渐被认识。由于其结构的特殊性,无论是未修饰的还是人工合成的细胞外囊泡都有可能在大分子药物传递中得到应用,成为治疗干预的潜在新靶点。近年来,随着互联网在全世界全行业内快速的发展,出现了许多权威的科研工具网站,科研工作者可以通过这些网站进行科研数据的分享、在线分析和设计等多种便捷的操作,大大加快了各领域科研工作的协作效率和未知科学问题的解读速度。本研究,通过对互联网权威的数据库进行分析,发现缺血性脑损伤区域内炎症趋化因子CXCL1的表达明显增加,CXCL1及其下游炎症因子NF-κB、IL-8、IL-6和TNF-α很可能直接参与了神经炎症的病理过程。众所周知,大脑主要由皮质神经元细胞和星型胶质细胞构成,两种细胞之间存在频繁而持续的交互作用。那么,缺血性中风发生后,过量表达的CXCL1与哪些细胞或因子有关?这些细胞或因子又通过何种方式参与调控了CXCL1的表达及神经炎症的进程?为此,我们进一步通过生物信息学分析网站,科学推断出CXCL1上游可能的调控因子miR-181c-3p。接下来,分别诱导了IBI动物模型和OGD细胞模型,通过形态学和分子生物学方法充分验证了上述数据和分析结果,并阐明了皮质神经元细胞-外泌体-星型胶质细胞间,通过miR-181c-3p来调控CXCL1表达并参与缺血性脑损伤神经炎症的具体分子机制。为研发对抗缺血性脑损伤神经炎症的有效药物提供新靶点,开辟新途径。第一部分缺血性脑损伤后,趋化因子CXCL1与炎症因子表达有关,受miR-181c-3p调控目的:从缺血性脑损伤模型中找到与神经炎症相关的重要因子,以及可调控该因子表达的micro RNA,并在MCAO模型中验证。方法:1.通过GEO数据库进行差异分析,采用MCAO法制备IBI大鼠模型,利用Morris水迷宫实验和术后脑形态学验证造模是否成功。2.通过RT real-time PCR和Western Blot方法分别检测假手术组和MCAO手术组大鼠脑组织miR-181c-3p和CXCL1的表达,通过ELISA法检测血清中NF-κB、IL-8、IL-6和TNF-α的水平。3.通过生物信息学预测网站预测可调控CXCL1的miRNA,用双荧光素酶报告基因分析法在HEK293细胞中验证。4.通过RT real-time PCR和Western Blot方法检测miR-181c-3p模拟物对星型胶质细胞CXCL1的m RNA和蛋白表达的影响。结果:1.CXCL1在缺血性脑损伤组织中高表达,可能受miR-181c-3p调控我们对GEO数据库中,缺血性脑损伤相关的GSE61616和GSE78731微阵列数据(MCAO模型)进行了差异分析。结果发现,缺血性脑损伤部位CXCL1均呈现高表达状态。我们通过生物信息学在线预测网站DIANA TOOLS、miR Walk和miR Search分别预测了可能与CXCL1结合的潜在miRNA,miR-181a-1-3p、miR-181c-3p和miR-711可能与CXCL1有结合位点。我们推测miR-181c-3p可能通过调节星型胶质细胞CXCL1的表达而影响IBI的神经炎症。采用大脑中动脉阻断(MCAO)法制备缺血性脑损伤(IBI)大鼠模型,利用Morris水迷宫实验和术后脑形态学观察,验证IBI大鼠模型的建立是否成功。从术后脑形态学观察比较24小时后脑梗死面积,可见假手术大鼠左右脑大小相等,无白色缺血痕迹,而MCAO大鼠右侧脑肿胀,右侧脑缺血明显。同样,Morris水迷宫实验的结果显示MCAO大鼠的逃逸潜伏期显著增加,且通过平台的频率与接受假手术的大鼠相比显著降低。以上结果证明我们成功的建立了IBI大鼠模型。通过RT real-time PCR和Western Blot方法分别检测假手术组和MCAO手术组大鼠脑组织miR-181c-3p和CXCL1的表达。结果发现,MCAO组大鼠脑组织中miR-181c-3p的表达明显低于假手术组,而CXCL1的蛋白表达水平明显高于假手术组,与GSE61616和GSE78731微阵列数据的差异分析结果一致。通过ELISA法检测假手术组和MCAO手术组大鼠血清中NF-κB、IL-8、IL-6和TNF-α的水平,结果显示,MCAO组大鼠炎症因子水平明显高于假手术组,说明IBI可引起炎症反应。2.CXCL1是miR-181c-3p的靶基因,并受其调控通过生物信息学预测网站预测miR-181c-3p与CXCL1的结合位点,发现miR-181c-3p可能与CXCL1发生特异性结合。为了验证其靶向关系,我们采用双荧光素酶报告基因分析法,将PGLO-CXCL1-Wt和miR-181c-3p模拟物共转染至HEK293细胞,发现其荧光素酶活性降低;而PGLO-CXCL1-Wt和miR-181c-3p抑制剂共转染至HEK293细胞,其荧光素酶活性显著升高;而突变后的PGLO-CXCL1-Mut和miR-181c-3p模拟物或抑制剂共转染至HEK293细胞,其荧光素酶活性无差异。上述结果提示miR-181c-3p可与CXCL1特异性结合,并调控其表达水平。通过RT real-time PCR和Western Blot方法检测miR-181c-3p模拟物对星型胶质细胞CXCL1的m RNA和蛋白表达的影响,进一步确定其靶向关系。结果表明,miR-181c-3p模拟物进入星型胶质细胞,导致其CXCL1的m RNA和蛋白表达均明显减少。以上结果表明,CXCL1是miR-181c-3p的一个靶基因,可以被它负性调控。小结:1.CXCL1在缺血性脑损伤组织中高表达,可能受miR-181c-3p调控2.CXCL1是miR-181c-3p的靶基因,并受其调控第二部分皮质神经元细胞外泌体中的miR-181c-3p对星型胶质细胞CXCL1表达有调控作用目的:原代培养星型胶质细胞和皮质神经元细胞,探讨OGD处理是直接还是间接影响的星型胶质细胞中CXCL1的表达。方法:1.从胎鼠脑组织中提取星型胶质细胞,倒置显微镜和免疫荧光染色观察星型胶质细胞的形态和CXCL1的表达。2.用OGD方法处理12小时模拟缺血性脑损伤状态,RT real-time PCR和Western Blot方法检测CXCL1表达变化。3.对RNALocate和Vesiclepedia数据库分析miR-181c-3p高表达的细胞或细胞外囊泡。4.原代培养皮质神经元细胞,免疫荧光染色法检测Tau蛋白标记物,通过电子显微镜观察来确定外泌体的存在。5.通过OGD处理皮质神经元细胞12小时,Western blot检测TGS101、CD63和GRP94的蛋白表达。6.试剂盒提取外泌体,RT real-time PCR检测miR-181c-3p在皮质神经元及其外泌体中的表达。结果:1.细胞外因素可调节星型胶质细胞中CXCL1的表达从胎鼠脑组织中提取星型胶质细胞,倒置显微镜下观察到星型胶质细胞比少突胶质细胞形态更不规则,细胞突起和分支丰富,免疫荧光染色显示GFAP蛋白标记物在星型胶质细胞中大量表达,并共定位观察到CXCL1的表达。将提取的星型胶质细胞随机分为两组,一组用缺糖缺氧(OGD)方法处理12小时模拟缺血性脑损伤状态,另一组不作任何处理作为对照。结果表明,OGD处理12小时后,星型胶质细胞GFAP和CXCL1的表达与未治疗组相比无显著性差异。这些结果表明,OGD处理不能引起星型胶质细胞内CXCL1表达的变化,提示CXCL1的表达可能受细胞外因素的调节。2.OGD处理的皮质神经元抑制外泌体分泌miR-181c-3p的作用我们对RNALocate和Vesiclepedia数据库的生物信息学分析发现miR-181c-3p在外泌体中高表达。为了验证皮质神经元细胞是否能释放外泌体,我们首先用免疫荧光染色法检测胎鼠皮质神经元Tau蛋白标记物的存在,以验证所获得的细胞是否为皮质神经元细胞。如图Fig.2C所示,Tau蛋白在细胞质中表达,表明成功提取了皮质神经元细胞。试剂盒提取和纯化皮质神经元释放的外泌体后,通过电子显微镜观察来确定外泌体的存在。细胞培养液上清液中可观察到形状类似盘状或杯状的致密固体,具有典型的双层膜结构,平均直径为100 nm,表明从皮质神经元细胞培养过程中成功提取了外泌体。为了进一步确定OGD是否影响皮层神经元外泌体的释放,通过OGD处理皮质神经元细胞12小时,诱导IBI模型后,Western blot结果显示,与对照组相比,OGD处理的细胞TGS101、CD63和GRP94的蛋白表达无显著差异。该结果表明OGD对皮质神经元细胞分泌外泌体的过程没有影响。通过RT real-time PCR检测miR-181c-3p在皮质神经元及其外泌体中的表达。结果显示,OGD处理的皮质神经元及其外泌体中miR-181c-3p的表达均明显低于对照组。上述结果表明,缺血性脑损伤可导致皮质神经元细胞及其外泌体中miR-181c-3p表达减少。小结:1.细胞外因素可调节星型胶质细胞中CXCL1的表达2.OGD处理的皮质神经元抑制外泌体分泌miR-181c-3p的作用第三部分皮质神经元释放的外泌体中携带的miR-181c-3p抑制星型胶质细胞CXCL1及其下游炎症因子的表达目的:通过皮质神经元提取的外泌体和星型胶质细胞共培养,探讨皮质神经元分泌的外泌体中miR-181c-3p对星型胶质细胞CXCL1表达的调控机制。方法:1.将皮质神经元细胞中提取的外泌体与星型胶质细胞共培养48小时,用PKH67标记外泌体后,倒置荧光显微镜观察星型胶质细胞对外泌体的吸收能力。通过RT real-time PCR、Western blot和ELISA观察炎症因子和CXCL1的表达变化。2.用miR-181c-3p模拟物或抑制剂处理星型胶质细胞,通过RT real-time PCR和Western blot检测CXCL1的表达变化。3.用miR-181c-3p的模拟物、抑制剂或si RNA转染星型胶质细胞,通过RT real-time PCR,Western blot和ELISA方法检测星型胶质细胞或细胞培养上清中炎性因子的表达变化。结果:1.皮质神经元释放的外泌体抑制星型胶质细胞炎症因子及CXCL1的表达将正常皮质神经元细胞提取的外泌体与星型胶质细胞共培养48小时,用PKH67标记外泌体后,倒置荧光显微镜观察星型胶质细胞对外泌体的吸收能力。星型胶质细胞中的绿色荧光代表的就是被吸收进入细胞内部的外泌体。用PBS+二甲基亚砜(DMSO)、皮质神经元释放的外泌体(CN Exo)+DMSO或CN Exo+GW4869处理后,对星型胶质细胞中CXCL1和炎性因子(NF-κB、IL-6、IL-8和TNF-α)表达的影响进行了评价。RT real-time PCR和Western blot结果显示,与PBS+DMSO相比,CN-Exo+DMSO处理的星型胶质细胞CXCL1的m RNA和蛋白质表达明显降低;与CN Exo+DMSO相比,CN Exo+GW4869处理的星型胶质细胞CXCL1的m RNA和蛋白质表达明显增加。上述结果表明,皮质神经元释放的外泌体下调了星型胶质细胞CXCL1的表达。根据RT real-time PCR、Western blot和ELISA的结果显示,与PBS+DMSO相比,CN Exo+DMSO处理的星型胶质细胞中各炎症因子的表达均减少,而CN Exo+GW4869处理的星型胶质细胞中各炎症因子的表达则增加。以上结果表明,皮质神经元分泌的外泌体可以抑制星型胶质细胞炎症因子和CXCL1的表达。2.皮质神经元释放的miR-181c-3p抑制了星型胶质细胞CXCL1表达为了进一步探讨外泌体中miR-181c-3p对星型胶质细胞CXCL1表达的影响,分别用CN-Exo、miR-181c-3p模拟物和miR-181c-3p抑制剂处理星型胶质细胞,通过RT real-time PCR和Western blot检测CXCL1的m RNA和蛋白质表达。结果显示,与阴性对照组(NC+PBS)相比,外泌体组(NC-simic+CN-Exo)或miR-181c-3p组(miR-181c-3p-simic+PBS)处理的星型胶质细胞中CXCL1的m RNA和蛋白质表达均明显下降,而外泌体和miR-181c-3p联合(CN-Exo+miR-181c-3p-simic)处理的星型胶质细胞中CXCL1的m RNA和蛋白质表达出现进一步下降。并且,在外泌体(CN Exo)和miR-181c-3p抑制剂同时存在的情况下,星型胶质细胞CXCL1的m RNA和蛋白质表达增加被逆转。上述结果表明,皮质神经元释放的外泌体中携带的miR-181c-3p可以抑制星型胶质细胞CXCL1的表达。3.miR-181c-3p通过下调CXCL1表达,抑制星型胶质细胞炎症为了证明星型胶质细胞中CXCL1与炎症的关系,我们用miR-181c-3p的模拟物、抑制剂或si RNA转染星型胶质细胞,通过RT real-time PCR和Western blot检测星型胶质细胞中炎性因子的表达,ELISA方法检测细胞培养上清中炎性因子的表达情况。结果显示,miR-181c-3p抑制剂处理后,星型胶质细胞中炎症因子表达明显增加,而miR-181c-3p模拟物或CXCL1的si RNA处理后,星型胶质细胞中炎症因子显著下降。此外,与对照组相比,虽然miR-181c-3p抑制剂及CXCL1的si RNA联合处理后,星型胶质细胞中炎症因子的表达降低(p<0.05),但仍明显高于CXCL1的si RNA单独处理组。以上结果表明,miR-181c-3p可通过抑制CXCL1的表达减少星型胶质细胞的炎症反应。小结:1.皮质神经元释放的外泌体抑制星型胶质细胞炎症因子及CXCL1的表达2.皮质神经元释放的miR-181c-3p抑制了星型胶质细胞CXCL1表达3.miR-181c-3p通过下调CXCL1表达,抑制星型胶质细胞炎症结论:1.缺血性脑损伤发生后,星型胶质细胞中趋化因子CXCL1及其下游炎症因子表达增高2.皮质神经元细胞可通过分泌外泌体被星型胶质细胞内吞来进行细胞间通讯3.皮质神经元细胞通过释放的外泌体中miR-181c-3p的含量,调控星型胶质细胞CXCL1及其下游炎症因子的表达