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目前已经有很多关于猪多能性干细胞的报道，但尚未获得有效的培养体系可以支持干细胞长时间稳定传代并实现生殖嵌合。胚胎质量和培养体系对胚胎干细胞的成功构建都具有重要意义。早期胚胎发育需要核心转录因子和相关信号通路共同发挥作用，而胚胎干细胞建立的过程相当于在体外添加化合物和细胞因子维持内细胞团(InnerCellMass, ICM)的多能性并提供营养物质维持其生长和增殖的过程。因此，本研究根据各阶段胚胎测序数据筛选出调控ICM发育相关通路的激活剂，再通过在猪早期胚胎体外培养液和胚胎干细胞培养液中添加该类小分子，最终确定其对猪早期胚胎质量和胚胎干细胞多能性的影响，主要结果如下：
1.通过对不同发育时期猪体内胚胎转录组数据进行分析并富集信号通路，结果表明：ICM形成过程中，WNT信号通路、cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路和JAK-STAT信号通路等参与调控ICM形成。在猪孤雌胚胎培养过程中分别添加富集到信号通路的小分子，筛选到CHIR99021和rpIL6可以促进囊胚发育。
2.组合添加1μMCHIR99021和10ng/mLrpIL6验证其对孤雌囊胚质量的作用。结果表明：囊胚率(49.23±8.40％v.s.32.34±4.15％，P＜0.05)、囊胚孵化率(16.19±1.96％v.s.10.25±1.12％，P＜0.05)、ICM细胞数(7.72±2.30v.s.4.28±1.60，P＜0.01)提高，多能性基因OCT4(P＜0.01)、SOX2(P＜0.01)和NANOG(P＜0.05)以及使WNT通路和JAK-STAT通路相关基因也上调表达。此外，此体系显著提高胚胎干细胞建系效率(KOFL体系：34.70±4.77％v.s.25.12±2.10％，P＜0.05；LCDMIV体系：37.82±2.56％v.s.25.26±3.18％，P＜0.01)。
3.用体外受精胚胎验证组合添加1μMCHIR99021和10ng/mLrpIL6的作用。结果表明此体系可以提高体外受精胚胎囊胚率(28.47±2.16％v.s.19.65±4.02％，P＜0.05)、ICM细胞数(6.60±1.50v.s.4.50±0.89，P＜0.01)、囊胚孵化率(12.03±1.73％v.s.7.27±0.79％，P＜0.05)，及OCT4(P＜0.01)、SOX2(P＜0.05)和NANOG(P＜0.01)的表达。
4.基于KOFL体系筛选提高细胞多能性的胚胎干细胞培养体系。结果表明：LCDM体系和添加rpIL6的LCDM体系都可以支持猪多能性干细胞维持，提高多能性基因OCT4、SOX2和REX1的表达；在KOFL体系基础上添加SB431542、CHIR99021和Forskolin可以提高单细胞传代能力，细胞增殖能力和多能性基因OCT4、SOX2和KLF4的表达。
5.用细胞转化筛选的体系进行从头建系并进行再次优化。结果表明：pPSCs-LCDMIV支持单细胞传代，多能性基因OCT4(P＜0.05)、SOX2(P＜0.01)和NANOG(P＜0.01)相对于pPSCs-KOFL的表达更高，细胞可传15代以上；pEPSC体系可以利用巴马品种的猪体内胚胎构建的胚胎干细胞系，细胞可以长时间稳定传代并维持较高的多能性，且具有分化为三胚层的能力；KOFL体系基础上添加SB431542、CHIR99021和Forskolin，维持高hLIF浓度并撤除bFGF组成LSCFors体系或者维持高bFGF浓度并降低hLIF浓度组成F-LSCFors体系，两个体系均可支持从头建系，多能性基因SOX2、NANOG和KLF4表达升高，但OCT4激活受限，细胞多能性部分提高。
6.通过转录组数据筛选pPSCS-LSCFors和pPSCS-F-LSCFors中表达的信号通路，结果表明：LSCFors体系中cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、JAK-STAT信号通路和MAPK信号通路等上调表达，F-LSCFors体系中cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、JAK-STAT信号通路和WNT信号通路等上调表达，参与调控细胞多能性。
以上结果表明，WNT信号通路、JAK-STAT信号通路、cAMP信号通路和PI3K-AKT信号通路等对于猪早期胚胎发育和胚胎干细胞多能性具有重要的调控作用。猪早期胚胎体外培养过程中激活WNT信号通路和JAK-STAT信号通路可以促进囊胚形成并提高囊胚质量。在猪胚胎干细胞培养过程中，添加细胞因子或化合物激活cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、JAK-STAT信号通路和WNT信号通路等对胚胎干细胞多能性的提高和细胞增殖具有重要的意义。本研究优化了猪早期胚胎和猪胚胎干细胞的培养体系，有利于获得更多优质胚胎及多能性提高的胚胎干细胞系。
1.通过对不同发育时期猪体内胚胎转录组数据进行分析并富集信号通路，结果表明：ICM形成过程中，WNT信号通路、cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路和JAK-STAT信号通路等参与调控ICM形成。在猪孤雌胚胎培养过程中分别添加富集到信号通路的小分子，筛选到CHIR99021和rpIL6可以促进囊胚发育。
2.组合添加1μMCHIR99021和10ng/mLrpIL6验证其对孤雌囊胚质量的作用。结果表明：囊胚率(49.23±8.40％v.s.32.34±4.15％，P＜0.05)、囊胚孵化率(16.19±1.96％v.s.10.25±1.12％，P＜0.05)、ICM细胞数(7.72±2.30v.s.4.28±1.60，P＜0.01)提高，多能性基因OCT4(P＜0.01)、SOX2(P＜0.01)和NANOG(P＜0.05)以及使WNT通路和JAK-STAT通路相关基因也上调表达。此外，此体系显著提高胚胎干细胞建系效率(KOFL体系：34.70±4.77％v.s.25.12±2.10％，P＜0.05；LCDMIV体系：37.82±2.56％v.s.25.26±3.18％，P＜0.01)。
3.用体外受精胚胎验证组合添加1μMCHIR99021和10ng/mLrpIL6的作用。结果表明此体系可以提高体外受精胚胎囊胚率(28.47±2.16％v.s.19.65±4.02％，P＜0.05)、ICM细胞数(6.60±1.50v.s.4.50±0.89，P＜0.01)、囊胚孵化率(12.03±1.73％v.s.7.27±0.79％，P＜0.05)，及OCT4(P＜0.01)、SOX2(P＜0.05)和NANOG(P＜0.01)的表达。
4.基于KOFL体系筛选提高细胞多能性的胚胎干细胞培养体系。结果表明：LCDM体系和添加rpIL6的LCDM体系都可以支持猪多能性干细胞维持，提高多能性基因OCT4、SOX2和REX1的表达；在KOFL体系基础上添加SB431542、CHIR99021和Forskolin可以提高单细胞传代能力，细胞增殖能力和多能性基因OCT4、SOX2和KLF4的表达。
5.用细胞转化筛选的体系进行从头建系并进行再次优化。结果表明：pPSCs-LCDMIV支持单细胞传代，多能性基因OCT4(P＜0.05)、SOX2(P＜0.01)和NANOG(P＜0.01)相对于pPSCs-KOFL的表达更高，细胞可传15代以上；pEPSC体系可以利用巴马品种的猪体内胚胎构建的胚胎干细胞系，细胞可以长时间稳定传代并维持较高的多能性，且具有分化为三胚层的能力；KOFL体系基础上添加SB431542、CHIR99021和Forskolin，维持高hLIF浓度并撤除bFGF组成LSCFors体系或者维持高bFGF浓度并降低hLIF浓度组成F-LSCFors体系，两个体系均可支持从头建系，多能性基因SOX2、NANOG和KLF4表达升高，但OCT4激活受限，细胞多能性部分提高。
6.通过转录组数据筛选pPSCS-LSCFors和pPSCS-F-LSCFors中表达的信号通路，结果表明：LSCFors体系中cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、JAK-STAT信号通路和MAPK信号通路等上调表达，F-LSCFors体系中cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、JAK-STAT信号通路和WNT信号通路等上调表达，参与调控细胞多能性。
以上结果表明，WNT信号通路、JAK-STAT信号通路、cAMP信号通路和PI3K-AKT信号通路等对于猪早期胚胎发育和胚胎干细胞多能性具有重要的调控作用。猪早期胚胎体外培养过程中激活WNT信号通路和JAK-STAT信号通路可以促进囊胚形成并提高囊胚质量。在猪胚胎干细胞培养过程中，添加细胞因子或化合物激活cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、JAK-STAT信号通路和WNT信号通路等对胚胎干细胞多能性的提高和细胞增殖具有重要的意义。本研究优化了猪早期胚胎和猪胚胎干细胞的培养体系，有利于获得更多优质胚胎及多能性提高的胚胎干细胞系。