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目的:1、使用miRNA芯片分析比较舌鳞状细胞癌病患组和健康组别的血清miRNA,筛查出异常表达的miRNA;2、对异常表达的miR-320a进行相关的生物学分析,预测可能的靶基因。方法:1、采用组织微阵列检测48例舌鳞状细胞癌患者及50例健康志愿者血清中microRNA的表达水平,qRT-PCR验证微阵列的数据;2、锁定寡核苷酸探针原位杂交技术和免疫组织化学方法,检测舌鳞状细胞癌组织及非舌鳞状细胞癌正常舌组织中miR-320a和MRP2表达水平,寻找miR-320a调节MRP2表达的组织学证据。结果:1、微阵列检测到总共有21种miRNAs表达异常,而其中miR-320a的表达呈现最明显的降低,P<0.05。进一步对OTSCC样本和健康人中4个表达有显著异常的miRNAs,包括miR-320a,miR-129,miR-106a和miR-31进行了qRT-PCR检测验证,表达趋势与微阵列一致,P<0.05。2、原位杂交技术和免疫组织化学结果显示:舌癌组织中miR-320a的表达水平显著低于正常舌组织,P<0.01;而舌癌组织中MRP2的表达水平显著高于正常舌组织,P<0.01。结论:miR-320a在舌癌患者血清中的表达水平显著低于在正常人血清中的表达,在舌癌组织中的表达水平也低于在正常组织中的表达;但是MRP2的表达水平却是增高的。提示我们可将miR-320a表达异常降低和MRP2异常增高现象作为舌鳞状细胞癌诊断的辅助参考指标。目的:1、观察外源性mi R-320a对SCC细胞系增殖、迁移、侵袭的影响。2、在SCC细胞系中验证MRP2是否是mi R-320a的天然靶基因,并探索mi R-320a抑制MRP2表达的分子机制。3、进一步观察过表达MRP2后,能否有效逆转mi R-320a对舌鳞状细胞癌细胞增殖的抑制作用。方法:1、以人SCC细胞系为研究对象,q RT-PCR检测舌癌细胞系(SCC4、SCC1)和正常角化细胞系(NHOK)中的mi R-320a的含量。2、通过向SCC细胞系转染mi R-320a mimics,提升细胞系中mi R-320a的水平,再开展下述实验:(1)CCK-8、克隆形成及Edu实验检查mi R-320a对SCC细胞增殖的作用影响;(2)用transwell体外迁移侵袭和划痕实验,分析miR-320a对SCC细胞迁移和侵袭功能的影响。3、通过q RT-PCR检测及Western blot技术检测转染mi R-320a mimics后对舌癌细胞系中MRP2m RNA及MRP2蛋白表达水平的影响,探索mi R-320a降低MRP2表达的分子机制;为验证MRP2是否为mi R-320a的天然靶基因,我们采用荧光素酶实验进行检测。4、构建MRP2真核生物过表达质粒转染入已转染了mi R-320a mimics的SCC细胞系,继而使得细胞内有过表达的MRP2,再用CCK-8实验以及Edu实验检验过表达MRP2可否有效逆转mi R-320a对舌鳞状细胞癌细胞增殖的抑制作用。结果:1、q RT-PCR检测结果显示,NHOK中mi R-320a的表达水平明显高于所检舌鳞状细胞癌细胞系,差异有统计学意义,P<0.001。2、CCK-8实验结果显示,mi R-320a显著的抑制了SCC细胞的增殖功能,450nm吸收值显著低于NC组,P<0.01;体外克隆实验结果显示,通过两周的体外培养,SCC细胞系内NC组以及mi R-320a组都存在细胞克隆,与对应的NC组进行对比,mi R-320a组的克隆细胞的形态明显偏小,核染较NC组也明显变浅,mi R-320a组的克隆形成效率(CFE)显著低于NC组,P<0.01。3、体外划痕实验结果显示,mi R-320a组SCC的间隙存留率(各时间点存留的间距/0h的划痕间距%)显著高于NC组的存留率,P<0.01~0.001。Transwell体外迁移实验得出,SCC细胞系mi R-320a组细胞透过纤维素膜孔的数目显著低于未转染的NC组,差别有统计学意义,P<0.001;体外侵袭的分析得出,SCCmi R-320a组穿过Matrigel的细胞数明显少于对应的NC组,两组侵袭能力也有显著差别,P<0.001。4、q RT-PCR检测结果显示,SCC细胞系mi R-320a组MRP2m RNA含量明显低于对应的NC组,差异有统计学意义P<0.05。Western blot检测结果显示,SCC细胞系mi R-320a组MRP2蛋白表达水平均显著低于对应的NC组,统计分析两组Gelpro测量灰度值有显著差异,P<0.05。5、荧光素酶分析检测结果显示,在SCC细胞系,mi R-320a-WT组的活性相对于Mock-WT组以及NC-WT组显著偏低,其差异有统计学价值,P<0.001,Mock-WT组以及NC-WT组之间无差异,P>0.05;同时,mi R-320aMT、Mock-MT和NC-MT三组突变型质粒转染组之间的差异无统计学价值,P>0.05,说明mi R-320a是通过靶向MRP23’UTR与MRP2m RNA转录结合,以达到相关功能效果。6、CCK-8实验显示过表达MRP2真核表达质粒,即320a+MRP2组的SCC两细胞系的450nm吸光度参数在各个观察时间点和NC组相比都没有统计学差异,P>0.05;转染48h后,320a+MRP2组和NC组都明显高于单纯转染了mi R-320a mimics的细胞(mi R-320a组),差异有统计学意义,P<0.001。在Edu实验中,SCC细胞系mi R-320a组Edu阳性细胞率显著低于NC组,P<0.001;而且,也明显的低于320a+MRP2组Edu阳性率,P<0.01~0.001。结论:1、舌鳞状细胞癌细胞系中mi R-320a表达水平明显低于口腔角质形成细胞系。2、外源性提高mi R-320a的含量水平能够有效抑制舌鳞状细胞癌细胞系细胞的增殖、迁移、侵袭能力。3、外源性提高mi R-320a的含量水平可有效诱导MRP2 m RNA的降解,并且能降低MRP2蛋白的表达水平。4、mi R-320a的天然靶基因为MRP2,mi R-320a可通过和MRP2m RNA3’UTR区的特殊位点特异结合而选择性降低MRP2的表达水平。5、过表达MRP2能有效逆转mi R-320a对舌鳞状细胞癌细胞增殖的抑制作用,说明MRP2在一定程度上介导了mi R-320a对舌鳞状细胞癌细胞增殖的抑制效应。