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研究背景和目的：淋巴细胞微粒(lymphocyte microparticles，LMPs)是当淋巴细胞受刺激活化或凋亡时从浆膜上脱落下来成为直径为0.05-1.0μm的小囊泡颗粒，可通过与靶细胞的相互作用启动靶细胞的生物学效应[1]。它具有抗凝、促炎反应、加重内皮损伤、影响血管收缩、诱导血管生长以及免疫调节等多种生物学活性[2]，尤其在慢性炎症方面作用突出，现已证实它与自身免疫性疾病关系密切。新近研究发现，LMPs能诱导巨噬细胞的凋亡，能够作用于内皮细胞诱导炎性介质白细胞介素6(interleuki-6，IL-6)、白细胞介素8(interleuki-8，IL-8)、前列腺素(Prostaglandin，PG)等的表达[3]，进而在调节免疫反应方面起重要作用，但具体机制尚不完全清楚。研究发现慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者外周血T淋巴细胞总数下降，凋亡增加，在急性加重期尤为突出[4]。我们课题组初步发现COPD患者的肺泡灌洗液中LMPs水平是升高的，但凋亡的T淋巴细胞所释放的LMPs是否对气道上皮细胞有影响，是否在气道炎症发生、发展中发挥重要作用,目前在国内外尚缺乏研究报道。针对这一现象我们加以假设展开研究。我们前期研究发现，LMPs能抑制人支气管上皮细胞(Human bronchial epithelialcells，16HBE)生长，使其生长周期阻滞在G1期，并且能诱导其凋亡，但引起16HBE细胞生长周期阻滞的具体机制尚不完全清楚[5]。因此，本研究拟通过对细胞生长周期调控基因以及相关周期蛋白的变化检测，探讨LMPs引起16HBE细胞生长周期阻滞的机制。以期为研究LMPs在气道炎症中所发挥的作用提供实验依据，为下一步构建疾病动物模型作铺路，最终为呼吸专科常见的哮喘和慢性阻塞性肺气肿等慢性气道炎症性疾病防治提供新的思路。方法本实验采用人类正常支气管上皮细胞株(16HBE)进行体外实验，对LMPs作用于16HBE细胞引起生长周期阻滞的相关调控蛋白进行检测，并对其具体机制进行探讨。具体如下：1、LMPs致16HBE细胞生长周期阻滞相关周期蛋白的研究1.1RT-PCR检测P21、P27、P57、P16的mRNA的水平表达将16HBE细胞培养在六孔板中到对数生长期时，20μg/ml的LMPs按照不同的时间0h、4h、8h、16h、20h、24h刺激16HBE细胞，提取总的RNA。采用引物延伸法，扩展目的片段，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳跑电泳进行分析。并用GIS凝胶图像处理系统。GIS密度分析软件分析目的基因条带的灰度值。1.2Western blot检测P21、 P27蛋白水平表达将16HBE细胞培养到对数生长期时，20μg/ml的LMPs按照不同的时间0h、4h、8h、16h、24h刺激16HBE细胞。提取蛋白，跑电泳，转膜，孵育抗体，ECL试剂反应显影；图像分析系统测定灰度值比值。2、LMPs致16HBE细胞生长周期阻滞机制的研究2.1Western blot检测p-FOXO1、FOXO1、p-AKT、AKT蛋白水平的表达情况将16HBE细胞培养到对数生长期时，20μg/ml的LMPs按照不同的时间0h、4h、8h、16h、24h刺激16HBE细胞。提取蛋白，跑电泳，转膜，孵育抗体，ECL试剂反应显影；图像分析系统测定灰度值比值。2.2激光共聚焦观察FOXO1蛋白的核定位变化按照1.5×10~4个细胞/孔的密度种植16HBE细胞爬片，60-70%的融合率时，按照0h、24h的时间点加入浓度为20μg/ml的LMPs刺激16HBE细胞。然后固定，通透，孵育抗体，染核，封片；激光共聚焦观察。2.3加入抑制剂LY294002后，Western blot检测p-AKT、AKT、p-FOXO1、FOXO1蛋白水平的表达情况60-70%的融合率时，向16HBE细胞中加入浓度为20μm/L的LY294002，共培养24h后，加入20μg/ml的LMPs刺激16HBE细胞24h。提取蛋白，跑电泳，转膜，孵育抗体；ECL试剂反应显影；图像分析系统测定灰度值比值。2.4加入抑制剂LY294002后，激光共聚焦观察FOXO1蛋白的核定位变化按照1.5×10~4个细胞/孔的密度种植爬片，60-70%的融合率时，向16HBE细胞中加入浓度为20μm/L的LY294002共培养24h后，加入浓度为20μg/ml的LMPs刺激16HBE细胞24h。然后固定，通透，孵育抗体，染核，封片；激光共聚焦观察。2.5加入抑制剂LY294002后,Western blot检测P21、P27蛋白水平的表达情况60-70%的融合率时，向16HBE细胞中加入浓度为20μm/L的LY294002共培养24h后，20μg/ml的LMPs加入刺激16HBE细胞24h。提取蛋白，跑电泳，转膜，孵育抗体；ECL试剂反应显影；图像分析系统测定灰度值比值。结果：1、LMPs致16HBE细胞生长周期阻滞相关周期蛋白的研究1.1浓度为20μl/ml的LMPs刺激16HBE细胞，24h能够使其生长周期阻滞在G1期(P<0.01)。RT-PCR检测发现，P21、P27在mRNA水平随着时间点的变化显著升高(P<0.01)，而P57、P16在mRNA水平无明显变化(P>0.05)。1.2Western blot检测发现，P21、P27在蛋白水平随时间点的变化表达亦明显升高,具有统计学差异(P<0.01)。2、LMPs致16HBE细胞生长周期阻滞机制的研究2.1Western blot检测FOXO1、p-FOXO1、AKT、p-AKT蛋白水平变化情况，结果显示：FOXO1、AKT的总表达水平无明显变化；但p-FOXO1、p-AKT表达水平随时间点变化逐渐减弱(P<0.01)。2.2细胞免疫化学观察到FOXO1在24h明显入核的现象(与0h比较))。2.3加入抑制剂LY294002后, FOXO1、AKT蛋白表达水平无明显变化，但其磷酸化水平增强(P<0.01)；FOXO1的核定位在24h后未观察到明显的进核现象，P21、P27蛋白表达水平无明显增高(P>0.05)。结论：1. LMPs作用于16HBE细胞引起其生长周期阻滞在G1期，是通过上调P21、P27的表达来实现的。2. LMPs抑制16HBE细胞的生长可能与p-AKT以及FOXO1的核定位有关。3. LMPs作用于16HBE细胞上调P21、P27蛋白的表达引起生长周期阻滞在G1期可能是通过AKT/FOXO1信号通路调节的。