胶质瘤是一种侵袭性强的原发性中枢神经系统瘤,每年导致大量胶质瘤患者死亡。由于其具有较强的侵袭性和耐药性,传统的治疗方法不能彻底去除胶质瘤,且预后效果差,因此开发新的治疗手段和化疗药物对胶质瘤病人具有极其重要的意义。多拉菌素是阿维菌素的衍生药物,属于大环内酯类抗寄生虫药物,可以广泛的抑制动物体内和体外的寄生虫活性,在家畜业中被大量使用。它与其它大环内酯类药物相比,多拉菌素在动物体内半衰期更长,吸收更快。前期研究发现伊维菌素及莫西克汀在体外和体内均有促进胶质瘤细胞凋亡和自噬的作用,因此被认为是潜在新型抗癌药物。然而,关于多拉菌素对肿瘤细胞的研究未见报道。在本实验中我们选用多拉菌素来处理胶质瘤细胞,通过MTT、平板克隆实验来检测多拉菌素对胶质瘤细胞增殖的影响;用划痕实验来探究多拉菌素对胶质瘤细胞迁移能力的变化;DAPI染色来检测胶质瘤细胞中细胞核的形态;流式细胞仪来检测胶质瘤细胞周期分布和细胞凋亡率;透射电镜和GFP-LC3瞬时转染来证明的自噬发生;Western blot分析检测多拉菌素对胶质瘤细胞周期、凋亡和自噬相关蛋白的表达水平变化;高通量测序来探究多拉菌素对胶质瘤细胞在转录水平上改变;在动物体内中,用HE染色、TUNEL和免疫染色等方法来检测胶质瘤细胞活力、凋亡和自噬的相关指标。以此来揭露多拉菌素在胶质瘤细胞生物学行为中的作用,为多拉菌素用于临床治疗胶质瘤提供了数据支撑与理论依据。研究结果如下:(1)多拉菌素抑制胶质瘤细胞增殖和迁移能力从MTT和平板克隆结果可知,多拉菌素以时间和剂量依赖的方式抑制U87和C6细胞的细胞活力,并且对正常胶质细胞SVGP12的细胞活力影响较小。其次,划痕实验表明多拉菌素处理细胞24 h后,U87和C6细胞迁移能力降低。(2)多拉菌素诱导胶质瘤细胞G0/G1期周期阻滞流式细胞术和Western blot结果表明,多拉菌素会使U87和C6细胞在G0/G1期的DNA数量显著增加并且相关周期蛋白表达量以剂量依赖方式下降(P<0.001)。(3)多拉菌素诱导胶质瘤细胞发生凋亡DAPI染色结果显示,多拉菌素处理U87和C6细胞出现大量的染色体凝集。其次,流式细胞仪检测结果发现细胞凋亡率随着多拉菌素浓度增加而上升(P<0.001)。最后,Western blot结果表明多拉菌素通过线粒体途径诱导U87和C6细胞发生凋亡(P<0.001)。(4)多拉菌素诱导胶质瘤细胞发生自噬透射电镜观察,多拉菌素处理U87和C6细胞48 h后,有自噬体的出现。GFP-LC3瞬时转染和Western blot结果也证明多拉菌素会导致U87和C6细胞中自噬流和自噬蛋白表达量的增加(P<0.001)。(5)自噬促进胶质瘤细胞增殖抑制和细胞凋亡当氯喹抑制自噬后,MTT吸光值和克隆形成能力都有所增加(P<0.01)。其次,DAPI和流式细胞仪结果表明,当自噬被抑制后,细胞核中染色质凝缩程度和细胞凋亡率均降低(P<0.01)。(6)多拉菌素在转录水平诱导胶质瘤细胞凋亡、自噬、细胞周期改变从KEGG和GO富集分析所知,差异基因在细胞周期、细胞凋亡和细胞自噬中发生大量的富集。此外,信号通路图显示,多拉菌素诱导C6细胞发生G0/G1期的阻滞。其次,多拉菌素通过线粒体通路诱导细胞凋亡。最后,多拉菌素主要通过PI3K/AKT/m TOR通路诱导细胞发生自噬。(7)荷瘤模型中,多拉菌素抑制胶质瘤细胞生长在胶质瘤细胞荷瘤模型中,多拉菌素处理的肿瘤体积较小,而且在实验过程证明多拉菌素在动物体内具有较低的副作用(P<0.01)。HE和ki67结果也显示多拉菌素治疗后,会使胶质瘤细胞的细胞活力降低(P<0.01)。(8)荷瘤模型中,多拉菌素诱导胶质瘤细胞发生凋亡和自噬TUNEL结果表明,多拉菌素处理之后的阳性细胞数显著增加。此外,免疫组化和Western blot结果表明,凋亡蛋白Cleaved caspase-3与Cleaved caspase-9的阳性细胞数和蛋白表达量明显增加,自噬蛋白LC3阳性细胞数和表达量显著升高,而p62阳性细胞数和表达量显著降低(P<0.01)。(9)荷瘤模型中,自噬抑制胶质瘤细胞活性的同时诱导细胞发生凋亡从肿瘤体积可以看出抑制自噬后,肿瘤体积变大。从检测的ki67的结果可知,抑制自噬后ki67阳性细胞数增加。其次,从TUNEL结果可知,自噬被抑制后TUNEL阳性结果降低。综上,我们发现多拉菌素在体内、体外会明显抑制胶质瘤细胞的活性,并且细胞的迁能力也受到抑制。同时,多拉菌素诱导胶质瘤细胞发生G0/G1期阻滞,并诱导胶质瘤细胞发生凋亡和自噬。另外,多拉菌素在体外及体内都可通过自噬来诱导胶质瘤细胞活性抑制和凋亡的产生。由此可知,多拉菌素可能会成为下一个治疗胶质瘤的潜在的有效的化疗药物。