[研究背景与目的]原发性肝癌(primay hepatic cancer，PHC)是全世界最常见的恶性肿瘤之一，每年至少有50万新发病例。包括中国东南，台湾，香港，韩国，泰国，新加坡，马来西亚的东南亚地区和热带非洲国家是全球发病率最高的地区，年发病率>10-20／10万，且发病率呈上升趋势。大多数肝癌合并有肝硬化，主要的致病因素有病毒性肝炎，酗酒及黄曲霉素的摄入。肝癌患者预后较差，未经治疗的肝癌患者的自然生存时间仅为8．4个月。肝切除术是治疗肝癌的有效方法，然而只有10-20％的肝癌在诊断时具有可切除性，而且患者行根治性治疗后复发率较高。在复杂的肝脏外科手术中(如肝叶切除、肝移植等)，为有效控制术中出血，不可避免地需要阻断入肝血流，但随着肝脏血流阻断时间延长肝门开放后，就会损害残肝增殖修复能力，容易诱发肝功能衰竭，引起缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，I／RI)。有研究发现，肝脏缺血再灌注与肿瘤的发生发展有关；缺血再灌注后氧化应激过程中产生的氧自由基对肿瘤组织可产生明显的损伤，最终导致细胞凋亡。由此认为，肝脏缺血再灌注除具有组织损伤的不利作用外，对肿瘤组织可能还具有杀伤和治疗作用。但另有研究发现，肝脏缺血再灌注损伤后促使余肝肉眼未见微小肿瘤病灶生长和增加微小病灶的侵袭转移。因此肝脏缺血再灌注对肿瘤组织是否有促进其生长转移的作用值得更为深入的探讨和研究。对缺血再灌注损伤机制的研究已较广泛，但对肝脏缺血再灌注损伤对肿瘤侵袭转移的影响报道鲜见。并且他们仅仅是以研究裸鼠体内肝脏转移直结肠癌为模型，通过先行I／R损伤后，然后在裸鼠体内脾脏植入直结肠癌细胞再形成转移性肝癌模型，检测I／R对肿瘤侵袭转移的影响。由于他们使用的是裸鼠，缺乏免疫反应，并且是先行I／R损伤，研究的是肝转移瘤的影响；所以不能完全反应和模拟我们体内的状况和手术情况，并且我们国内以肝硬化后肝癌为主，直结肠转移性肝癌较西方少，所以有必要以更符合我国国情的研究肝硬化后肝癌的模型来研究I／R损伤对肝癌的影响。因此，我们利用鼠缺血再灌注损伤模型研究缺血再灌注与肿瘤侵袭转移的关系，并试图探讨减少此类损伤的方法。[研究方法]1．通过构建人肝癌细胞原位种植裸鼠的动物模型，建立裸鼠肝癌缺血再灌注损伤模型；进行肝脏酶学检测，观察缺血再灌注损伤后血浆中ALT和AST的变化；实时荧光定量PCR检测VEGFmRNA和MMP-9mRNA表达水平；观察缺血再灌注损伤后肿瘤的生长状况。肿瘤组织H-E染色病理观察缺血再灌注损伤对肿瘤组织细胞的生长影响，和对正常肝实质细胞的影响。根据实验数据试图初步证实缺血再灌注损伤与肝癌肿瘤组织侵袭转移的关系及其机制的探讨。2．根据实验第一部分的数据，考虑到裸鼠的免疫系统缺陷，我们又以二乙基亚硝胺(DEN)诱导的SD大鼠形成肝硬化后肝癌模型，此模型形成的肿瘤以动脉供血为主，并具有肝细胞增生和肝硬化背景，更接近临床实际情况。我们应用第一部分的实验方法，观测缺血再灌注损伤后肿瘤组织的生长变化；肝脏酶谱检测血浆中ALT和AST的动态变化；实时荧光定量PCR检测VEGFmRNA和MMP-9mRNA表达水平；H-E染色，观测缺血再灌注损伤后组织细胞病理的动态变化。试图探讨其对肿瘤细胞侵袭转移和微小病灶生长影响的机制。[实验结果]1．肝癌裸鼠I／R模型建立的结果BALB／c裸鼠皮下接种Hep3 B细胞后5 d可在接种部位扪及大小约3mm的皮下结节，待肿块长至直径1 cm时切取肿瘤进行裸鼠肝癌模型的建立。将切取下的肿瘤组织剪成小块约(1×1×1 mm~3)，用镊子塞到接种针的针孔中，接种到裸鼠肝脏实质中。3 w后，打开裸鼠腹腔，约三分之二的裸鼠肉眼可见荷瘤肝脏，大小约(0．5 cm)，各荷瘤裸鼠间肿瘤大小无明显差异；并同时行肝脏缺血再灌注损伤实验。术后2 w观察假手术组、I／R手术组和手术自身对照组肿瘤体积分别为209．6±25．74 mm~3、3 30．6±32．01 mm~3和22 1．6±23．26 mm~3，三组的肿瘤质量分别为0．214±0．036 g、0．374±0．045 g和0．238±0．024 g，统计学分析结果表明，假手术组与手术自身对照组间无统计学差异(P>0．05)，而手术组与假手术组和自身对照组者之间具有统计学显著性差别(P<0．01)。2．SD大鼠肝癌I／R模型建立的结果经肝癌诱导剂二乙基亚硝胺诱导SD大鼠约100d形成大鼠肝硬化后肝癌模型。第100 d，打开SD大鼠腹腔，肉眼可见肝硬化后的肝癌，全肝结节性肝硬化表现，约0．3-0．6 cm大小的肿瘤；各荷瘤大鼠间肿瘤大小无明显差异。各对照组通过肿瘤组织取代正常肝组织的范围(HRA)计数中肝叶+左肝叶与右肝叶+尾状叶的肿瘤HRA无明显统计学差异，分别为26．7％和24．9％(P>0．05)，两者肿瘤HRA比率接近1。由此，我们可以得出通过大鼠体内右肝叶+尾状叶的肝脏组织可以作为大鼠行中肝叶+左肝叶缺血再灌注损伤的内部控制自身对照组。术后2 w观察假手术组、I／R手术组和手术自身对照组肿瘤数目分别为3．24±1．72个、5．71±2．14个和2．83±1．56个，肿瘤体积分别为183．2±17．68 mm~3、386．3±24．65 mm~3和1 69．7±20．11mm~3统计学分析结果表明，假手术组与手术自身对照组间无统计学差异(P>0．05)，而手术组与假手术组和自身对照组者之间具有统计学显著性差别(P<0．01)。3．I／R术后肝脏酶学检测结果裸鼠和SD大鼠缺血再灌注损伤后1h，I／R手术组血浆ALT和AST增高，随着再灌注时间的延长，术后6 h手术组血浆ALT和AST升高更显著(P<0．01)。而假手术组术后1h和6h血浆ALT和AST无明显变化(P>0．05)。而I／R手术组与假手术组无论是术后1 h还是6 h，血浆ALT和AST水平间均有统计学差异(P<0．01)。4．VEGF和MMP-9 mRNA在肝组织中的表达裸鼠和SD大鼠经I／R损伤术后1 h和6 h取材，行实时荧光定量PCR技术检测发现，与假手术组比较术后1 h的I／R手术组癌旁的VEGF和MMP-9 mRNA表达明显升高(P<0．01)，并且术后6 h的I／R手术组肿瘤的VEGF和MMP-9 mRNA升高更为显著。缺血再灌注的时间的延长癌旁组织中VEGF和MMP-9 mRNA均升高，两者呈一定的正相关性。5．肿瘤组织常规病理观察结果取裸鼠和SD大鼠缺血再灌注损伤5 d后的假手术组和手术组(术后5 d和7 d)的肝癌组织行H-E染色。术后5 d的手术组肿瘤周边组织炎症细胞侵润、坏死区域较假手术组更明显(P<0．05)。而I／R术后7 d的手术组的肿瘤周边坏死区域较术后5 d的手术组明显减少(P<0．05)，并且肿瘤周边的坏死区域被肿瘤细胞侵润代替。[研究结论]1．经过缺血再灌注损伤后，促进了肿瘤细胞的生长。2．经过缺血再灌注损伤后，促进了肝组织的VEGF及MMP-9基因表达增高。3．经过缺血再灌注损伤后，促进了肿瘤细胞的侵袭转移和微小病灶的形成生长。4．缺血再灌注损伤促进肿瘤细胞的侵袭转移和微小病灶的形成生长的作用机制可能涉及VEGF及MMP-9基因的表达和调控。总之，本论文以裸鼠和大鼠肝癌缺血再灌注损伤为研究模型，通过体内实验，应用多种方法研究证实经过缺血再灌注损伤后，促进了肿瘤细胞的生长，并且促进了肿瘤细胞的侵袭转移和微小病灶的形成生长，初步探讨了其可能涉及的作用机制。为临床肝癌手术切除方式的选择提供更多参考，并为缺血再灌注损伤促进肝癌的侵袭转移提供更好的实验平台和实验资料。