背景乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁女性的身心健康。全世界乳腺癌的发病率一直呈稳步上升的趋势,20世纪末的统计资料表明世界每年约有115万人诊断为乳腺癌,有41万人死于该病,发病年龄也有年轻化趋势,是导致女性肿瘤患者死亡的第一大原因。然而,乳腺癌的病因尚不十分清楚,其发病机制也非常复杂,影响发病的因素很多。近年来,随着肿瘤分子病理学和分子生物学研究的深入,人们认识到肿瘤的发生和发展是一个多阶段、多基因改变参与的渐进过程。多个癌基因的异常激活和编码蛋白的过度表达以及抑癌基因的缺失、突变失活导致细胞增殖失控而恶性转化,可能是肿瘤发生的分子生物学基础。随着新的治疗理念的提出和综合治疗的实施,乳腺癌的治疗水平不断提高,总生存率也在逐渐提高,但复发和转移仍是乳腺癌治疗失败和死亡的主要原因,因此研究乳腺癌生物学行为,寻找治疗敏感性相关生物学标志物将有助于临床工作。HIF-1α和Her-2是乳腺癌两个独立的预后因子,对乳腺癌的发生、发展和转移有重要影响,在乳腺癌中的生物学作用以及作为提示乳腺癌的预后因素和针对其研制特异性的单克隆抗体来治疗乳腺癌日益成为近年来乳腺癌研究的热点。但以往国内外研究多见于免疫组化对乳腺癌的研究,免疫组化研究操作比较复杂、耗时、费力,而且不能对患者进行实时、动态检测病情变化,目前对HIF-1α和Her-2ECD在乳腺癌血清中的联合定量检测尚无相关报导。甘氨酸、丙氨酸作为肿瘤细胞重要的合成原料和代谢产物,受HIF-1α通道调控,在肿瘤的发生、发展和转归都有举足轻重的作用,但相关研究亦未见报道,故寻找一种新的检测方法,定量分析人体代谢途径中相关的肿瘤标志物,尽可能提高肿瘤标志物的检出率是非常重要的。本课题利用悬浮芯片技术联合高效液相色谱定量检测乳腺浸润性导管癌患者血清中HIF-1α、Her-2ECD、Ala和Gly含量变化规律,分析其内在的相关性及其与乳腺癌临床病理、生物学特性的关系；探讨HIF-1α、Her-2ECD、Ala和Gly在乳腺癌诊断和监测病情的作用,以及评估其对乳腺癌诊断的价值。目的本研究拟从乳腺癌患者机体的代谢途径寻找动态的肿瘤标志物,探讨他们之间内在相关性。研究采用悬浮芯片联合高效液相色谱技术,分析HIF-1α、Her.2ECD、甘氨酸和丙氨酸的含量变化,及其与临床病理因素和预后的关系,并进一步探索HIF-1α、HER-2ECD、Ala和Gly在乳腺癌诊断、预后评估和疗效评价中的价值和意义。方法1.病例来源选自宁波大学医学院附属医院乳腺外科2006-2008年住院病人,其中乳腺原发浸润性导管癌117例,术后复发乳腺浸润导管癌10例,乳腺良性肿癌20例,体检健康拟行乳腺美容手术31例(正常对照)。乳腺原发浸润性导管癌术前均未进行相关放疗、化疗、内分泌治疗及免疫治疗。2.血清标本采集所有入选对象在清晨空腹采肘正中静脉血10ml,静置120分钟,3000r/min离心20分钟取血清,编号,-80℃冰箱保存,待检(根据术后的病理结果筛选保存的乳腺浸润性导管癌和良性肿瘤及乳腺美容患者血清标本冷藏待检)。3.组织标本的采集术中将手术切除的恶性肿瘤或良性肿瘤标本切取无坏死的瘤组织各约1g,以及在行乳腺美容手术时切取正常组织约1g,然后用冰盐水冲洗除掉血污,立即置入液氮中,保存于-80℃低温冰箱。检测前分别取少许肿瘤组织,称重后用质量分数为0.9%的冰冷生理盐水按150mg:1.5ml的比例在冰浴下超声粉碎制成10%的肿瘤组织匀浆,以4000r/min(离心半径8cm)离心10min,取上清液冷藏保存待检测。4.检测方法血清HIF-1α和Her-2ECD含量采用悬浮芯片试剂盒检测(检测范围>1pg),并用酶联免疫吸附(ELISA)法测定做对照(HIF-1α检测范围：10000-156pg;Her-2ECD检测范围：>0.39ng/ml)。血清和组织中甘氨酸和丙氨酸利用高效液相色谱法检测,利用配套软件计算出含量。5.统计学分析采用SPSS13.0软件进行,所有数据以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用方差分析(F检验),组间两两比较采用t检验,P<0.05为差异,有统计学意义。对液相芯片法与ELISA或HPLC的检测结果采用Spearson积矩相关分析,检验水准,a=0.05。结果1.临床病例资料：本研究四组共178例,均为女性,年龄分布为27-91岁,中位年龄49.2岁。乳腺原发浸润性导管癌117例,年龄27-91岁(平均51.56岁)；术后复发乳腺浸润导管癌10例,年龄35-57岁(平均47.6岁)；乳腺良性肿瘤20例,年龄40-63岁(平均50.38岁)；乳腺美容31例(正常对照),年龄27-65岁(平均48.77岁)。四组入选病人年龄没有统计学差异(P>0.05)。乳腺原发浸润性导管癌术前均未进行相关放疗、化疗、内分泌治疗及免疫治疗,临床病理分期：Ⅰ期25例(21.5%)、Ⅱ期61例(52.1%)、Ⅲ期19例(16.2%)、Ⅳ期12例(10.3%)；病理组织学分级：G1期12例(10.3%)、G2期41例(35.0%)、G3期64例(54.7%)；肿瘤大小：T1组<2cm 41例(35.0%)、T2组>2cm,≤5cm 61例(52.1%)、T3组>5cm15例(12.8%)；淋巴结转移情况：无转移69例(59.0%)、转移48例(41%)。2.悬浮芯片法检测结果2.1原发浸润性导管癌、复发浸润性导管癌、良性肿瘤组和正常对照组血清HIF-1α含量组间有统计学差异(F=200.035,p=0.000)；复发浸润导管癌组血清HIF-1α含量(231.72±38.39)高于原发浸润导管癌(166.18±59.15)(P<0.05)；良性肿瘤组(47.77±15.26)和正常对照组(47.84±11.36)血清中HIF-1α含量之间没有统计学意义(P>0.05)。原发浸润性导管癌血清HIF-1α含量均高于良性肿瘤组及正常对照组(P<0.01)；复发浸润性导管癌血清HIF-1α含量也均高于良性肿瘤组及正常对照组(P<0.01)；原发乳腺浸润性导管组血清HIF-1水平含量在临床病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期组间有统计学差异(F=15.030,p=0.000)：Ⅰ期(150.96+38.85)、Ⅱ期(149.52±52.96)之间没有统计学差异(P>0.05)；Ⅲ期(189.03±60.36)、Ⅳ期(249.54±44.84)之间有统计学差异(P<0.01)；Ⅰ期与Ⅲ期及Ⅳ期之间均有统计学差异(P<0.01)；Ⅱ期与Ⅲ期及Ⅳ期之间也均有统计学差异(P<0.01)：发乳腺浸润性导管癌组血清HIF-1水平含量在组织学分级中组间有统计学差异(F=18.772,p=0.000)：随低分化(182.42±61.79)、中分化(154.39±52.67)和高分化(119.80±23.28)组织分化程度升高其含量逐渐减低,有统计学差异(P<0.01)；肿瘤直径大于5cm(T3)其血清HIF-1水平含量(215.19±57.11),高于T1(152.42±41.05)、T2(161.82±61.69)两组,有统计学差异(P<0.01),但T1组、T2组没有统计学差异(P>0.05)。淋巴结转移组血清HIF-1水平含量(197.48±55.28)高于没有淋巴结转移组(144.40±51.80),有统计学差异(P<0.01),孕激素受体阴性表达组(186.16±59.35)高于阳性表达组(153.23±55.69),有统计学差异(P<0.01)；雌激素受体阳性表达组(159.91±56.41)与阴性表达组(179.20±63.27)之间没有统计学差异(P>0.05)。2.2原发浸润性导管癌、复发浸润性导管癌、良性肿瘤组和正常对照组血清Her-2ECD含量组间有统计学差异(F=50.924,p=0.000)；复发浸润导管癌组血清Her-2ECD含量(17.61±3.63)高于原发浸润导管癌(11.20±6.116)(P＜0.05)；良性肿瘤组(4.91±3.40)和正常对照组(4.56±2.95)血清中Her-2ECD含量之间没有统计学意义(P>0.05)。原发浸润性导管癌血清Her-2ECD含量均高于良性肿瘤组及正常对照组(P<0.01)；复发浸润性导管癌血清Her-2ECD含量也均高于良性肿瘤组及正常对照组(P<0.01)；原发乳腺浸润性导管组血清Her-2ECD水平含量在临床病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期组间有统计学差异(F=71.912,p=0.000)；Ⅰ期(7.89±2.94)与Ⅱ期(9.30±4.48)之间没有统计学差异(P>0.05)；Ⅲ期(15.44±6.38)与Ⅳ期(21.67±2.76)之间有统计学差异(P＜0.01)：Ⅰ期与Ⅲ期及Ⅳ期之间均有统计学差异(P<0.01)；Ⅱ期与Ⅲ期及Ⅳ期之间也均有统计学差异(P<0.01)；发乳腺浸润性导管癌组血清Her-2ECD水平含量在组织学分级中组间有统计学差异(F=18.086,p=0.000)：肿瘤组织低分化组的Her-2ECD含量(13.04±6.53)高于中分化组(9.33±5.33)和高分化组(7.80±1.12),有统计学差异(P<0.01)中分化组与高分化组之间没有统计学差异(P=0.251)：Her-2ECD水平含量随T1组(7.98±3.35)、T2组(11.17±6.03)、T：组(18.02±5.57)肿瘤直径增大而含量增高(T3>T：>T1),有统计学差异(P<0.01)；淋巴结转移组Her-2ECD的含量(15.75±7.06)高于没有淋巴结转移组(8.04±2.15),有统计学差异(P<0.01)；雌激素受体阴性表达组血清Her-2ECD水平(13.49±6.43)高于雌激素受体阳性表达组(10.10±5.68),有统计学差异(P<0.01)。孕激素受体阴性表达组的Her-2ECD水平(13.05±6.42)高于孕激素受体阳性表达组(10.01±5.64),有统计学差异(P＜0.01)。3.高效液相色谱法检测结果3.1原发浸润性导管癌、复发浸润性导管癌、良性肿瘤组及正常对照组血清中Ala含量组间有统计学差异(F=20.635,p=0.000)；复发浸润导管癌组血清中Ala含量(240.71±74.33)低于原发浸润导管癌(338.57±97.37)(P<0.05)；良性肿瘤组(414.49±64.94)和正常对照组(423.37±80.57)血清中Ala含量之间没有统计学意义(P>0.05)。原发浸润性导管癌血清Ala含量均低于良性肿瘤组及正常对照组(P<0.01)；复发浸润性导管癌血清Ala含量也均低于良性肿瘤组及正常对照组(P<0.01)原发浸润性导管癌、复发浸润性导管癌、良性肿瘤组及正常对照组血清中Gly含量组间有统计学差异(F=150.986,p=0.000)；复发浸润导管癌组血清中Gly含量(135.49±31.34)低于原发浸润导管癌(176.06±46.96)(P＜0.01)良性肿癌组(320.22±42.84)和正常对照组(342.19±48.15)血清中Gly含量之间没有统计学意义(P>0.05)。原发浸润性导管癌血清Gly含量均低于良性肿瘤组及正常对照组(P<0.01)；复发浸润性导管癌血清Gly含量也均低于良性肿癌组及正常对照组(P<0.01)原发浸润性导管癌、复发浸润性导管癌、良性肿癌组及正常对照组组织中Ala含量组间有统计学差异(F=161.011,p=0.000)：复发浸润导管癌组织中Ala含量(224.62±44.96)低于原发浸润导管癌(177.14±67.99)(P<0.05)；良性肿瘤组(437.44±58.10)和正常对照组(406.50±66.85)组织中Ala含量之间没有统计学意义(P>0.05)。原发浸润性导管癌组织Ala含量均低于良性肿瘤组及正常对照组(P<0.01)：复发浸润性导管癌组织Ala含量也均低于良性肿瘤组及正常对照组(P<0.01)。原发浸润性导管癌含量、复发浸润性导管癌、良性肿瘤组及正常对照组组织中Gly含量组间有统计学差异(F=141.398,p=0.000)；复发浸润导管癌组组织中Gly含量(204.64±40.94)低于原发浸润导管癌(147.92±56.74)(P＜0.01)；良性肿瘤组(327.32±46.93)和正常对照组(338.06±49.60)组织中Gly含量之间没有统计学意义(P>0.05)。原发浸润性导管癌组织Gly含量均低于良性肿瘤组及正常对照组(P<0.01)；复发浸润性导管癌组织Gly含量也均低于良性肿瘤组及正常对照组(P<0.01)。3.2原发乳腺浸润性导管组血清Ala含量在临床病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期组间有统计学差异(F=32.863,p=0.000)；Ⅰ期(433.51±67.69)、Ⅱ(342.90±74.78)、Ⅲ期(272.42±60.76)及Ⅳ期(210.05±82.32)随临床病理分期增高含量逐渐降低,有统计学差异(P<0.01)；原发乳腺浸润性导管癌组血清Ala含量在组织学分级中组间有统计学差异(F=5.511,p=0.005)；低分化(389.91±76.27)、中分化(362.99±92.43)和高分化(313.29±97.36)三组随肿瘤组织分化程度升高而含量水平逐渐下降,均有统计学差异(P<0.01)；原发乳腺浸润性导管组血清Ala含量在不同大小肿瘤组之间有统计学差异(F=51.067,p=0.000)；T1组(421.19±75.45)、T2组(323.10±87.08)、T3组(241.02±43.87)随肿瘤体积增大含量逐渐减少,有统计学差异(P<0.01)；淋巴结转移组血清Ala水平(297.72±96.01)低于没有发生转移组的水平(366.98±88.35),有统计学差异(P<0.01)：雌激素受体的阳性表达组(343.37±90.31)和阴性表达组(328.58±111.27)孕激素受体的阳性表达组(349.52±96.23)与阴性表达组(321.67±97.75)的血清Ala水平之间没有统计学意义(P>0.05)。3.3原发乳腺浸润性导管组血清Gly含量在临床病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期组间有统计学差异(F=24.621,p=0.000)；Ⅰ期(202.88±37.91)与Ⅱ期(186.18±36.57之间没有统计学差异(P>0.05)；Ⅲ期(152.54±30.75)与Ⅳ期(101.78±45.21)之间有统计学差异(P<0.01)；Ⅰ期与Ⅲ期及Ⅳ期之间均有统计学差异(P<0.01)：Ⅱ期与Ⅲ期及Ⅳ期之间也均有统计学差异(P<0.01)；原发乳腺浸润性导管癌组血清Gly含量在组织学分级中组间有统计学差异(F=23.602,p=0.000)；高分化组(217.50±25.89)与中分化组(199.12±39.35)之间没有统计学意义(P>0.05)；低分化组(153.520±42.089)与高、中分化组之间均有统计学差异(P<0.01)；原发乳腺浸润性导管组血清Gly含量在不同大小肿瘤组之间有统计学差异(F=10.403,p=0.000)；T1组(195.832±37.076)与T2组(177.103±45.486)没有统计学意义(P=0.081)；T1与T3组(130.260±43.177)及T2和T3(p=0.000)均有统计学差异；淋巴结转移组血清Gly水平(152.158±46.436)低于没有发生转移组的水平(192.69±39.85),有统计学差异(P<0.01)；雌激素受体的阳性表达组(181.75±42.12)和阴性表达组(164.22±54.41)、孕激素受体的阳性表达组(182.73±45.163)与阴性表达组(165.767±48.31)的血清Gly水平之间亦没有统计学差异(P>0.05)。4. HIF-1α、Her-2ECD和Ala、Gly之间的相关性分析：Spearson积矩相关分析表明,乳腺癌血清HIF-la与Her-2ECD呈正相关(r=0.533,p=0.000)；乳腺癌血清与组织中Ala(r=-0.429,p=0.000)的含量变化呈负相关：血清与组织中Gly(r=-0.481,p=0.000)的含量变化也呈负相关；Spearman等级相关分析示：在乳腺浸润性导管癌中血清HIF-1α水平与血清Ala(r=-0.403,p=0.000)呈负相关,在血清HIF-1α水平与Gly(r=-0.413,p=0.000)呈负相关；血清Her-2ECD与血清Ala(r=-0.509,p=0.000)水平呈负相关,血清Her-2ECD与血清Gly(r=-0.481,p=0.000)也呈负相关。5. HIF-1α(87.1%)和Gly(96.6%)对乳腺癌诊断率高于Her-2CED (69.7%)和Ala(67.4%),HIF-1α的对乳腺癌早期诊断效果高于Her-2CED(P<0.01);Her-2CED(84.6%)对乳腺癌淋巴结转移的符合率高于HIF-1α(67.5%)、Ala(64.1%)和Gly(65.8%)。Her-2CED对乳腺癌淋巴结的转移诊断效果优越HIF-1α(P<0.01)。6.通过配对t检验及其相关性分析、判别分析及ROC曲线分析,运用悬浮芯片技术同时定量检测血清HIF-1α和Her-2ECD的能力不低于单一比对ELISA试剂盒,悬浮芯片检测结果高于对比试剂盒的检测结果,两种方法检测HIF-1α(r=0.995,p=0.000)和Her-2ECD (r=0.998, p=0.000)结果呈正相关,相关性非常密切。结论1.运用悬浮芯片技术联合检测血清HIF-1α和Her-2ECD两种肿瘤标志物的含量,与比对试剂盒比较的相关性好,实验结果可靠,灵敏度高、操作简单,对乳腺癌的诊断和研究具有较高的辅助价值。可用于临床检测和课题实验研究。2.乳腺浸润性导管癌HIF-1α和Her-2ECD水平过表达,是病人预后不良的指征,其过度表达说明它在肿瘤发生、转化中起重要作用。所以动态检测乳腺浸润性导管癌血清HIF-1α和Her-2ECD水平可提供实时、动态的信息,为制定治疗方案提供帮助。因此检测血清HIF-1α和Her-2ECD水平的动态变化对乳腺浸润性导管癌复发、转移的早期判断及预后评估具有重要意义。3.Ala和Gly参与了乳腺浸润性导管癌细胞的合成和能量代谢,在乳腺浸润性导管癌的发生、发展和转归中有重要作用,可能成为乳腺浸润性导管癌靶向治疗新的靶点。4.血清HIF-1α、Her-2ECD、Ala和Gly可作为乳腺癌的早期诊断、评价乳癌恶性程度和预后比较全面的指标,能准确的反映乳腺浸润性导管癌的生物学特性,随着对血清Her-2ECD、HIF-1α、Ala和Gly基础和临床研究深入以其为靶点的治疗可能成为肿瘤治疗和预防的重要手段之一。