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洛克沙胂(Roxarsone,Rox)具有促生长、抗菌、抗球虫等功效,作为饲料添加剂在畜禽生产中被广泛使用。但近年来研究表明Rox在体内外可促进血管生成,存在着诱导血管新生相关疾病发生的风险。VEGF可与血管内皮细胞表面的VEGFR2结合进而将信号传导至下游,对血管新生发挥调控作用。mTOR是PI3K/AKT信号通路的下游分子,在肿瘤生成和血管生成中具有调控作用。本课题组前期研究中发现Rox在体内外能够促进血管生成,使VEGF/VEGFR2以及PI3K/AKT表达上调。本文借助课题组前期构建的靶向Vegfr2基因shRNA重组慢病毒,转染大鼠血管内皮细胞并用于小鼠基质胶塞模型,以及利用小鼠黑色素移植瘤模型的体内试验,通过Rox或雷帕霉素处理,考察对基质胶塞、移植瘤及其血管生长的影响;Western Blot检测VEGF/VEGFR2、mTOR相关蛋白的表达,研究Rox体内促血管生成中VEGF/VEGFR2-mTOR 调节机制。在小鼠基质胶塞模型的体内试验中,血管内皮细胞与基质胶注射于小鼠皮下,建立基质胶塞模型。不同处理如下:PBS组、1.0 μM Rox处理组、shRNA干扰与Rox共处理组(Rox+RNAi组)、shRNA干扰组(RNAi组)。测定胶塞的重量、体积及血红蛋白含量,并对胶塞进行HE染色及CD34免疫组化分析,Western Blot检测VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR的表达。结果表明,Rox组基质胶塞体积、重量及血红蛋白含量均显著增加,分别是PBS组的2.10、1.69、1.49倍;胶塞组织中VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白的表达水平亦显著升高(P<0.05)。与Rox组相比,Rox+RNAi组胶塞的体积、重量、血红蛋白、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白的表达均显著调降低(P<0.05)。靶向Vegfr2基因shRNA干扰可显著抑制Rox对基质胶塞的生长及其血管生成的促进作用,对Rox引起的mTOR信号上调也有显著抑制作用。在小鼠B16F10黑色素移植瘤模型中,不同处理分组如下:PBS组、25 mg/kg Rox组、shRNA干扰与Rox共处理组(Rox+RNAi组)、shRNA干扰组(RNAi组)、阴性shRNA感染对照组(NC组)。重组慢病毒与B16F10细胞注射于小鼠腋下,于注射第二天连续7天灌胃给予Rox或PBS,每天1次。测量小鼠体重、肿瘤体积及重量;肿瘤组织进行HE染色及CD34免疫组化分析,Western Blot检测VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR的表达。结果表明Rox处理组小鼠的移植瘤体积和重量均显著增加,瘤重约为PBS组的1.53倍;Rox+RNAi组瘤重极显著减小,约是Rox组的0.65倍。Rox组肿瘤组织中VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白的表达均显著上调(P<0.05)。与Rox组比较,Rox+RNAi组肿瘤组织中VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白表达均显著降低(P<0.05)。靶向Vegfr2基因shRNA干扰可显著抑制Rox对B16F10移植瘤及其血管生长的促进作用,对Rox引起的mTOR信号上调也有显著抑制。在大鼠血管内皮细胞的体外试验中,不同处理分为PBS组、1.0μM Rox处理组、靶向Vegfr2基因shRNA干扰与Rox共处理组(Rox+RNAi组)、shRNA干扰组(RNAi组)、Rox与雷帕霉素共处理组(Rox+RAPA组)、雷帕霉素处理组(RAPA组)和shRNA阴性对照组(NC组)。MTT法检测血管内皮细胞的活性,Western Blot检测VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR的表达。结果表明Rox能够促进血管内皮细胞生长,显著上调VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白的表达(P<0.01)。与Rox组比较,Rox+RNAi组细胞活力、VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白水平均显著降低(P<0.05);Rox+RAPA组VEGFR2及mTOR表达无显著差异,但VEGF和p-mTOR的表达极显著降低(P<0.001)。靶向Vegfr2基因的RNA干扰可显著抑制Rox对内皮细胞生长,及VEGF/VEGFR2-mTOR信号的促进作用;RAPA可抑制Rox对内皮细胞的促进作用,并下调VEGF、p-mTOR蛋白的表达。综上所述,洛克沙胂在体内可显著促进基质胶塞和小鼠黑色素移植瘤的生长及其血管生成,靶向Vegfr2基因RNAi可有效抑制洛克沙胂对基质胶塞和黑色素移植瘤的生长及血管生成。VEGF/VEGFR2-mTOR信号在Rox体内促血管生成中发挥重要调节作用。