前言 尽管多年来肿瘤诊断、治疗等方面的研究已经有了长足进展，但是有关肿瘤转移的机制仍然不明确，肿瘤转移仍是目前大多数肿瘤患者的主要死亡原因，故肿瘤细胞转移机制研究已成为肿瘤研究的热点与重点。 卵巢透明细胞癌和卵巢浆液性腺癌为恶性程度较高、易转移、复发率高、预后差的两种组织学类型。卵巢浆液性腺癌占卵巢癌的50～60％左右，具有高度侵袭性，易早期发生淋巴管脉管浸润，易发生盆、腹腔播散，预后差。卵巢透明细胞癌仅占卵巢癌4～6％，发现时虽然多达60％的为Ⅰ期，但是卵巢透明细胞癌具有早期转移、早期复发、5年存活率低、预后差的特点，故日益引起国内外妇科肿瘤研究者的关注。 本课题从临床与基础两方面，对临床资料完整的良性卵巢浆液性腺瘤、交界性卵巢浆液性腺瘤、卵巢浆液性腺癌和原发性卵巢透亮细胞癌组织标本进行ER、PR、nm23—H1、E—cadherin、AKT、pAKT蛋白表达的检测，并分析其在卵巢上皮性癌患者预后中的作用及与肿瘤转移的关系；并采用分子生物学技术，了解雌、孕激素对这些蛋白的调节作用及其信号传导通路，为临床理解卵巢浆液性腺癌与透明细胞癌的特征与发展，提供理论依据。 Ⅰ 临床研究 目的：探讨ER、PR、nm23—H1、E—cadherin、AKT、pAKT蛋白表达与卵巢上皮性肿瘤生物学行为及其预后的关系。 方法：采用免疫组织化学方法检测卵巢透明细胞癌、卵巢浆液性腺癌、交界性卵巢浆液性囊腺瘤、卵巢浆液性囊腺瘤组织标本ER、PR、nm23—H1、E—cadherin、AKT、pAKT蛋白表达。 结果：卵巢透明细胞癌、卵巢浆液性腺癌ER、PR、nm23-H1、E—cadherin阴性表达或低表达，而AKT、pAKT则阳性表达或高表达。这些异常表达均与临床期别、细胞分化、淋巴转移及复发密切相关。 结论：ER、PR、nm23—H1、E—cadherin阴性表达或低表达与AKT、pAKT阳性表达或高表达的卵巢透明细胞癌、卵巢浆液性腺癌预后较差。 Ⅱ 基础研究 采用分子生物学技术，了解雌、孕激素对肿瘤转移相关蛋白nm23—H1、E—cadherin、AKT、pAKT表达的调节作用及其信号传导通路，为临床理解卵巢透明细胞癌与卵巢浆液性腺癌的特征与发展，提供理论依据。 第一部分 雌、孕激素对卵巢透明细胞癌、卵巢浆液性腺癌转移的影响 目的：探讨雌、孕激素对卵巢透明细胞癌、卵巢浆液性腺癌迁移的作用及其对转移抑制基因nm23—H1蛋白表达的影响。 方法：以蛋白印迹法检测雌、孕激素作用后，ES-2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白的表达改变，了解nm23—H1蛋白的表达量与雌、孕激素作用时间及剂量的关系。通过细胞划痕法，观察雌、孕激素作用24小时、48小时后，细胞向划痕区弥合情况。应用transwell方法，计数移至微孔膜下的细胞数，评价其转移的能力。 结果：①17-β雌二醇可降低ES-2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白表达；醋酸甲羟孕酮则增加ES-2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白表达，作用呈浓度和时间效应；②17-β雌二醇可增强ES-2、SKOV3细胞的迁移能力；醋酸甲羟孕酮则减弱ES-2、SKOV3细胞的迁移能力。 结论：雌激素可通过降调ES-2、SKOV3细胞转移抑制基因nm23—H1蛋白表达，促进肿瘤细胞的转移。降调作用与雌激素浓度及作用时间呈负相关；孕激素升调ES-2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白的表达、减缓肿瘤细胞的转移。升调作用与孕激素浓度及作用时间呈正相关。 第二部分雌、孕激素对卵巢透明细胞癌、卵巢浆液性腺癌转移相关信号传导通路的研究 目的：研究雌、孕激素对卵巢透明细胞癌、卵巢浆液性腺癌转移的作用及其对nm23—H1蛋白表达影响的信号传导通路的研究。 方法：以蛋白印迹法检测雌、孕激素作用后，ES-2、SKOV3细胞AKT、pAKT蛋白表达的改变，并了解AKT、pAKT蛋白的表达量与雌、孕激素作用时间及剂量的关系。以AKTRNA干扰技术处理后，蛋白印迹法检测雌、孕激素作用对ES-2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白表达的影响。蛋白印迹法检测雌、孕激素作用于ES-2、SKOV3细胞过程中，PI3K／AKT及MAPK通路抑制剂对ES-2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白表达的影响。应用transwell方法，评价AKT RNA干扰及PI3K／AKT或MAPK通路抑制剂对ES-2、SKOV3细胞转移能力的影响。 结果：①雌激素可增加ES—2、SKOV3细胞pAKT蛋白表达；孕激素则降低ES-2、SKOV3细胞pAKT蛋白表达。两者作用均呈剂量和时间效应；②雌激素可通过激活AKT磷酸化信号传导通路，降调细胞转移抑制基因nm23—H1蛋白表达；孕激素通过抑制AKT磷酸化信号传导通路，升调细胞转移抑制基因nm23—H1蛋白表达；③雌激素与PI3K／AKT抑制剂同时作用或AKT的SiRNA干扰后，减弱雌激素对ES—2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白升调节作用，减弱雌激素对ES—2、SKOV3细胞促进转移的能力；孕激素与PI3K／AKT抑制剂同时作用或AKT的SiRNA干扰后，减弱孕激素对ES—2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白降调节作用，减弱孕激素对ES—2、SKOV3细胞抑制转移的能力。而MAPK信号传导通路抑制剂则对性激素作用于ES—2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白表达及细胞转移无影响。 结论：雌、孕激素可通过细胞内PI3K／AKT磷酸化信号通路调控nm23—H1蛋白表达。 第三部分 雌、孕激素对卵巢透明细胞癌、卵巢浆液性腺癌HIF—1α蛋白表达的调控 目的：研究雌、孕激素对卵巢透明细胞癌、卵巢浆液性腺癌HIF—1α蛋白表达的影响及HIF—1α与nm23—H1的关系。 方法：以蛋白印迹法检测雌、孕激素作用后，ES-2、SKOV3细胞HIF—1α蛋白表达的改变，并了解HIF—1α蛋白表达量与雌、孕激素作用时间及剂量的关系。以AKT RNA干扰技术处理后，以蛋白印迹法检测雌、孕激素作用对ES-2、SKOV3细胞HIF—1α蛋白表达影响。以蛋白印迹法检测雌、孕激素在作用于ES-2、SKOV3细胞过程中，PI3K／AKT及MAPK通路抑制剂对ES-2、SKOV3细胞HIF-1α蛋白表达影响。以HIF RNA干扰技术处理后，采用蛋白印迹法检测雌、孕激素作用对ES-2、SKOV3细胞nm23-H1蛋白表达影响。采取HIF过表达的方法，以蛋白印迹法检测雌、孕激素作用对ES-2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白表达影响。 结果：①雌激素可增加ES-2、SKOV3细胞HIF—1α蛋白表达；孕激素则降低ES-2、SKOV3细胞HIF—1α蛋白表达。两者作用均呈剂量与时间效应；②雌激素通过激活AKT磷酸化信号传导通路，升调HIF—1α蛋白表达；孕激素通过抑制AKT磷酸化信号传导通路，降凋HIF—1α蛋白表达；③雌激素与PI3K／AKT抑制剂同时作用，减弱雌激素对ES—2、SKOV3细胞HIF—1α蛋白表达的升调节作用；孕激素与PI3K／AKT抑制剂同时作用，抑制孕激素对HIF—1α蛋白表达的降调节作用。MAPK信号传导通路抑制剂对性激素作用于ES—2、SKOV3细胞HIF—1α蛋白表达无调节作用；④当HIF—1α过表达时，雌激素对ES—2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白表达降调节作用增强；HIF—1α RNAi干扰后，雌激素对ES—2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白表达降调节作用减弱。当HIF—1α过表达时，孕激素对ES—2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白表达升调节作用增强；HIF—1α RNAi干扰后，孕激素对ES—2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白表达升调节作用减弱。 结论：雌、孕激素可通过细胞内PI3K—AKT磷酸化信号通路调控HIF—1α蛋白表达。HIF—1α又是参与调控nm23—H1蛋白表达的一个上游信号，而细胞外信号调节酶MAPK通路对其无影响。 课题总结 1、ER、PR、nm23—H1、E—cadherin阴性表达或低表达及AKT、pAKT阳性表达或高表达的卵巢透明细胞癌、卵巢浆液性腺癌预后较差。 2、雌激素可通过细胞内PI3K／AKT磷酸化信号通路上调ES—2、SKOV3细胞HIF-1α蛋白表达，并下调nm23-H1蛋白表达，从而促进卵巢癌细胞的转移。