【摘 要】
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目的:从临床疑似真菌感染性角膜炎患者的角膜刮片中分离、提取DNA,建立一种临床常见真菌的基因聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测方法,进行实验研究以及临床
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目的:从临床疑似真菌感染性角膜炎患者的角膜刮片中分离、提取DNA,建立一种临床常见真菌的基因聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测方法,进行实验研究以及临床应用。方法:根据医学真菌的线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因片段合成了镰刀菌、青霉菌、拟青霉菌、白僵菌、红酵母等5种临床常见真菌的通用引物。取临床标本,分离真菌菌株,采用应用改良的GenTLETMDNA试剂盒提取方法方法提取DNA,用以上引物以及真菌通用引物ITS以及COI扩增基因组的ITS和COI的基因片段并测序,在GenBank核酸序列数据库进行同源序列搜索及分析,用限制性内切酶SspI及VspI酶切目的片段,行2.0%TAE琼脂糖凝胶电泳照相观察,分析比较酶切图谱,初步检测其特异性。结果:各菌株基因组DNA经ITS1、ITS4扩增后得到的片段长度约为550bp,产物分别回收进行核苷酸序列测定,并与GenBank中相应序列进行比对,以鉴定菌种。各菌株基因组DNA经COI-all1,COI-all2引物扩增后得到的目的片段长度在450bp左右。测序后进行酶切分析,用限制性内切酶SspI及VspI酶切目的片段,根据酶切图谱可以进一步将镰刀菌鉴定到种。结论:本研究中6种菌15株均可以用COI-all1,COI-all2引物扩增,得到450bp左右的片段。使用COI扩增的茄病镰刀菌,尖孢镰刀菌,串珠镰刀菌的PCR产物经VspI和SspI两种限制性内切酶酶切条带具有种内多态性,提示可以用于鉴别镰刀菌属的种间鉴定。限制性片段长度多态性分析方法可用于快速、简便地将镰刀菌鉴定到种,有很好的应用前景。
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