论文部分内容阅读
萼脊兰（Sedirea japonica）为兰科（Orchidaceae）萼脊兰属（Sedirea）植物，其花小而素雅，花色清丽，且具有奇妙的幽香，观赏期长，养护简单且耐寒，是一种观赏价值很高的附生兰。近年来随着分子生物学在花卉相关研究及其在育种过程中的应用，兰科植物相关基因特别是开花相关基因及其表达也成为当今研究的热点，但是对萼脊兰开花相关基因的研究还很少。本研究以萼脊兰的花瓣为材料，采用RT-PCR和RACE技术等方法，克隆出了萼脊兰与开花相关的AP1（APETALA1）基因的保守序列及其全长序列开放阅读框(ORF)的扩增，并对该序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR技术分析该基因在生长发育过程中不同时期不同部位的表达特性，并对萼脊兰AP1(APETALA1)基因进行了植物表达载体的构建。主要研究结果如下: 1萼脊兰AP1(APETALA1)基因cDNA全长序列的克隆及序列分析 以萼脊兰的花期花瓣为材料，通过植物总RNA提取试剂盒提取萼脊兰花期花瓣总RNA，并运用RT-PCR方法克隆了萼脊兰AP1(APETALA1)基因的保守序列片段，其中与蝴蝶兰、建兰、文心兰的同源性分别为:99％，90％、88％。采用RACE技术的方法扩增3端和5端，得到一条萼脊兰AP1(APETALA1)基因的全长序列，长度为1221bp，其中开放阅读框（ORF）为753bp，编码250个氨基酸，5端非编码区为66bp，3端非编码区为402 bp。采用生物学信息分析方法对萼脊兰AP1基因氨基酸理化性质及同源性进行分析，并构建系统发育树，对保守区及二级结构进行分析及预测。 2萼脊兰AP1(APETALA1)基因植物表达载体pCAMBIA1304-EJAP1的构建 将测序结果正确的pMD19-EJAP1和质粒pBI221经限制性内切酶SmaⅠ/XbaⅠ双酶切后，经T4DNA连接酶连接到中间载体pBI221上，构建中间载体质粒pBI221-EJAP1。再将酶切结果正确的中间载体pBI221-EJAP1和植物表达载体pCAMBIA1304经限制性内切酶PstⅠ/EcoRⅠ双酶切后，将回收的目的基因片段与植物表达载体pCAMBIA1304用T4DNA连接酶连接，构建植物重组表达质粒pCAMBIA1304-EJAP1。经过菌落筛选和PCR双酶切验证，最终得到萼脊兰AP1（APE TALA1）基因的植物表达载体pCAMBIA1304-EJAP1，为遗传转化及杂交验证打下基础。 3采用实时荧光定量PCR技术对萼脊兰AP1基因进行时空表达分析 分别提取萼脊兰不同发育阶段不同部位组织的RNA，反转录为cDNA进行实时荧光定量PCR，按照Rel.Exp=2-△△Ct公式进行目的基因相对表达量的计算，结果发现，萼脊兰AP1基因在苗期、花蕾期、盛花期的营养器官和生殖器官中都有表达，且具有不同的表达丰度特性。在苗期，根和叶中表达量较低;在花蕾期，根和叶中的表达量与苗期相似，具有较低的表达量;而花葶和花蕾中表达量较高，花葶中表达量最高;在盛花期，根中的表达量比叶高，仍以花葶的表达量为最高，在花器官中，AP1基因在花瓣、萼片、唇瓣有微量表达，在蕊柱有较高表达，在子房中的表达量最高。结果分析表明，萼脊兰AP1(APETALA1)基因不仅在启动花分生组织和花器官分化中起着重要作用，而且在也参与其它组织的发育。