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高谷氨酸(α-氨基己二酸),是一种非蛋白质氨基酸,被广泛应用在医药化工等领域中,但目前主要依靠化学合成法生产,存在着成本高、收率低、污染严重的问题,因此采用经济、绿色友好的生物合成法来生产α-氨基己二酸具有研究价值。本论文设计了两条α-氨基己二酸的生物合成途径,通过体外酶活测试完成外源酶的筛选,将其导入大肠杆菌体内进行发酵,成功检测到目标产物,实现生物合成α-氨基己二酸,最后利用代谢工程改造大肠杆菌逐步提高目标产物产量。具体研究如下:1、两条合成路径均是分两步生成目标产物,第一步以赖氨酸为底物生成α-氨基己二酸-δ-半醛(AASA),第二步用α-氨基己二酸-δ-半醛脱氢酶(AASADH)催化AASA生成α-氨基己二酸。首先测定酵母氨酸途径中第一步所用酿酒酵母(Sc)和阿维菌素链霉菌(Sa)来源的赖氨酸酮戊二酸还原酶(LKR)和酵母氨酸脱氢酶(SDH)的体外活性,发现只有酿酒酵母来源的ScLKR和ScSDH有体外活性。测定转氨酶途径中第一步所用红城红球菌(Re)和黄杆菌属(F1)来源的赖氨酸氨基转移酶(LAT),发现均有活性且黄杆菌属来源的FlLAT活性较高转化速率可达17.47±0.33 μM/min。之后测定红城红球菌(Re)和恶臭假单胞菌(Pp)来源的AASADH,发现其均有活性且红城红球菌来源的ReAASADH 较优,转化速率可达 0.037± 0.0013 μM/min。2、由于转氨酶途径较短且酶活较高,后续实验选用转氨酶途径,外源酶选择FlLAT和ReAASADH。将外源途径中的基因导入大肠杆菌体内添加赖氨酸进行发酵,成功检测到目标产物说明转氨酶途径构建成功,利用敲除赖氨酸分解代谢基因的大肠杆菌实现α-氨基己二酸的从头合成。再对外源基因进行模块优化,最优产量为96.34 mg/L,随后对发酵培养基中氮源进行优化。3、对上游代谢基因的组合进行筛选并对表达量进行优化,产量增加到152.90 mg/L,引入谷氨酸棒杆菌来源的ddh基因代替大肠杆菌内dapD、dapC、dapE、dapF四个基因,缩短代谢途径,产量达184.26mg/L,产物检测过程中发现发酵液中有一定量的赖氨酸积累,敲除赖氨酸外排蛋白编码基因lysE后产量达300.39 mg/L。使用进一步改造的菌株(替换启动子等)进行发酵,产量达到1006.30 mg/L,最后将ddh基因整合在改造菌株的基因组上进行发酵,最终产量可达1328.23 mg/L。