近年来,在生物学研究领域,基因编辑(Genome editing)技术是研究人员了解特定基因功能和生产新的基因编辑动物的最新研究技术。随着越来越多的物种全基因组测序的完成,如何从大量的数据中获得基因相关功能和应用信息成为研究人员面临的新挑战。基因编辑技术是实现这一重要目标的强大研究工具,并被科学界评为2012年十大重要科学进步之一。最近几年,基因编辑技术迅速发展,先后出现了锌指核酸酶技术(Zinc-finger nucleases,ZFN)、TALE核酸酶技术(Transcrition activator like effector nucleases,TALENs)和CRISPR/Cas9系统(CRISPR/Cassystem)。CRISPR/Cas9技术具有简单、高效的优点,在其问世以来,科研工作者先后运用此技术生产出了基因编辑牛、羊等改良家畜,在畜禽育种方面展现出了良好的应用前景。随着动物基因编辑技术的迅速发展,基因编辑动物的产业化也显示出良好的应用前景,然而与基因编辑植物和微生物相比,基因编辑动物及其产品的生物安全检测则相对滞后。近年来,基因编辑动物的生物安全问题也逐渐受到关注,不仅仅是基因编辑动物及其产品的安全性,而且上升到基因编辑动物对整个生态坏境的影响程度。因此,对基因编辑动物的生物安全检测显得尤为重要,是基因编辑动物实现产业化的唯一途径。VEGF(Vascular endothelial cell growth factor,VEGF)是一种血管内皮生长因子,可以在人和动物的毛囊中表达,是毛乳头细胞(Dermal papilla cells,DPC)的一种自分泌生长因子,具有促进毛发生长的功能。本实验室利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和体细胞克隆技术生产出以Kap6.1为启动子的VEGF基因定点整合绒山羊,这种绒山羊较野生型显示出了良好的生产性状,在羊绒产量方面显著提升。但是在VEGF基因编辑绒山羊的生产中,在保障绒山羊产绒量增加的前提下,是否存在个体以及环境生物安全问题还有待进一步研究。因此本实验通过对VEGF基因编辑绒山羊进行扩繁,获得后代个体,对后代个体的个体生长状况、血液、组织器官等各项生理指标进行检测,并对相关环境进行基因漂移检测,为今后对基因编辑动物的生物安全检测提供实验依据。(1)VEGF基因编辑绒山羊后代获得本实验通过对耳号为1618号的VEGF基因编辑绒山羊进行超数排卵,经胚胎移植后获得4只羔羊,耳号分别为1812(♀)、1813(♀)、1817(♂)、1819(♂)。经鉴定,其中1813号、1817号和1819号呈基因编辑阳性。1819号正常饲养用于扩繁与生长指标监测;1813号(♀)和1817号(♂)在断乳后宰杀,取主要组织器官及代谢产物,以同龄同性别的绒山羊作为对照,用于VEGF基因编辑绒山羊个体安全与环境安全两方面的检测。(2)VEGF基因编辑绒山羊个体生物安全检测本实验对两只VEGF基因编辑绒山羊利用qPCR和Western Blot进行VEGF基因表达量的检测,分别以GAPDH基因和α-tubulin基因为内参,其结果与对照组绒山羊进行对比。结果显示,1813、1817号绒山羊的皮肤中mRNA的表达量分别是对照组绒山羊的2.07倍和2.24倍,在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等器官组织中,mRNA表达量与对照组并无显著差异;Western Blot检测结果与qPCR结果一致。之后对其血液,包括肝功、肾功等血常规、大生化的检测,以及各个组织器官的脂肪酸与氨基酸代谢情况进行检测,结果发现,VEGF基因编辑绒山羊各项指标与对照组均无明显差异。随后对VEGF基因编辑绒山羊与对照组绒山羊的肠道微生物进行了16s rRNA的检测,得到了肠道微生物在门、纲、目、科、属方面的分析统计数据,结果显示VEGF基因编辑绒山羊与对照组绒山羊在肠道微生物组成与丰度方面无明显差异。我们持续对VEGF基因编辑绒山羊的个体生长状况进行了追踪,包括各个时期的体长、身高、体重、胸围,并绘制生长曲线,结果显示与对照组无显著差异。(3)VEGF基因编辑绒山羊环境安全检测为了检测环境安全,我们在基因漂移方面做了肠道微生物漂移与周围土壤微生物漂移,结果均未在肠道微生物与土壤微生物基因组中检测到目的基因。以上实验结果表明,以Kap6.1为启动子的VEGF基因编辑绒山羊的目的基因具有皮肤组织表达特异性,在其他组织器官中并不会产生表达量的改变,对个体生长发育无明显影响,且不会发生基因漂移现象。上述检测为今后对基因编辑动物生物安全进行更深层次的研究提供了实验依据,研究结果显示VEGF基因编辑绒山羊在绒山羊育种中具有良好的应用前景。