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植物体细胞胚胎发生是新品种规模化无性繁殖的主要手段,也是植物细胞全能性研究的理想模式系统,在林木育种、种质保存和遗传转化等方面都有重要的科学意义和应用价值。然而,很多植物体细胞胚发生体系还不完善,存在技术难度大、质量不高、发生数量低、畸形胚比例高且难以同步化等问题。体细胞胚胎发生作为落叶松大规模无性繁殖的重要途径,深入研究体细胞胚发生的表观遗传调控机理,揭示其调控模式,可为进一步调控低质量胚胎发生体系向高效稳定胚胎发生体系转变提供理论基础和科学依据。本研究以杂种落叶松(Larix leptolepis×L. principis-rupprechtii)胚性细胞系Y35为实验材料,通过MSAP(Methylation-Sensitive Amplified Polymorphism)技术,以落叶松体细胞胚的原胚团时期(0 h)以及ABA诱导的早期单胚(0.5 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d)、中期单胚(7 d、14 d)、晚期单胚(21 d)、早期子叶胚(28 d)、中期子叶胚(35 d)、晚期子叶胚(42 d)等7个发育阶段14个发育时期的体细胞胚为实验材料,研究其DNA甲基化水平与模式变化,并首次克隆了DNA甲基转移酶MET1和染色质重塑因子DDM1基因全长cDNA,进行结构预测和分子进化等生物信息学分析。依据所获得的实验数据,探讨落叶松体细胞胚胎发生过程中的表观遗传调控机制,为落叶松体细胞胚胎发生机理研究奠定基础。主要结果如下:1. DNA甲基化研究表明:体细胞胚胎发生过程中3-42 d时5′-CCGG-3′胞嘧啶总甲基化率负对数值(y)随时间(x)变化拟合函数y = -2E-08x6 + 3E-06x5-0.0002x4 + 0.004x3 -0.0514x2 + 0.2885x + 0.5398(R2 = 0.973)。体细胞胚发育时期与总甲基化率负对数极显著,表明在一定程度上可以推测某些发育时期的总DNA甲基化率。2.总甲基化率在14个时期的中期单胚时期(14 d)最高,晚期子叶胚时期(42 d)最低;全甲基化率(双链5′-CmCGG-3′)的最高在ABA诱导后6 h,而最低在晚期子叶胚的42 d;半甲基化率(单链5′-mCCGG-3′)最高时期是ABA诱导2 d,而最低是0.5 h。每两相邻时期的DNA甲基化模式变化分析发现:在5′-CCGG-3′序列的胞嘧啶上,ABA诱导0.5-6 h时,超甲基化最多;而在早期单胚向中期子叶胚转变的5-7 d时,超甲基化最少。同时,在早期单胚向中期子叶胚转变的5-7 d,去甲基化最多;而在中期单胚到晚期单胚发生的14-21 d,去甲基化最少。3.与原胚团时期相比,各时期DNA甲基化模式变化分析发现:ABA诱导第5 d时,也即体细胞胚胎发生至早期单胚时,超甲基化最多;而在第7 d时,即早期单胚开始向中期单胚发育时,超甲基化最少。同时,ABA诱导第14 d,即体细胞胚胎发生至中期单胚阶段,去甲基化最多;而在第2 d时,去甲基化最少。4.部分差异条带回收、测序、比对发现与编码核糖体蛋白S13(ribosomal protein S13)同源的序列,该片段来自E37+H/M61引物组合对ABA诱导后第14 d中期单胚的Msp I酶切连接产物的扩增。5.利用MET1保守域序列兼并引物进行落叶松cDNA扩增,得到403 bp的特异片段,分析得知为落叶松MET1的特异序列,其65-77 aa为酶活性中心。分别通过3’ RACE和5’ RACE得到1404 bp和3788 bp片段,获得全长5303 bp。其中,1-77 bp为5’ UTR区,4872-5303 bp为3’ UTR区,编码1731个氨基酸,分子量194.67 kDa,命名为LlMET1。通过PFAM和CDD(Conserved Domain Database,NCBI)蛋白结构预测:LlMET1含有两个BAH结构域,两个DNMT1-RFD结构域,两个DNA甲基酶结构域,以及Dcm等多个结构域。系统进化树研究发现LlMET1和油棕(Elaeis guineensis)DNA甲基转移酶MET1的进化关系相近。搜索Y35体细胞胚成熟与原胚团时期的SSH差减文库,发现编码染色质重塑因子相关蛋白DDM1的片段,通过RACE进一步扩增得cDNA全长。系统进化树发现落叶松的LlDDM1与小立碗藓(Physcomitrella patens)的PpDDM1具有较近的进化关系。综上所述,落叶松体细胞胚胎发生过程中,存在着频繁的DNA甲基化水平变化,并在一定时期与体细胞胚发生时间具有一定关系。同时,也存在频繁的DNA甲基化模式变化。DNA甲基转移酶MET1和染色质重塑因子DDM1全长cDNA克隆及系统进化分析表明:落叶松的LlMET1和油棕的EgMET1具有较近进化关系,LlDDM1与小立碗藓的PpDDM1具有较近的进化关系。