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研究目的和背景:
齐多夫定是目前最有效的抗艾滋病病毒药物之一,一系列大规模临床试验肯定了其在抗艾滋病治疗中的作用,然而有研究发现齐多夫定在临床治疗中存在不可忽视的个体差异。目前认为基因多态性所致药物代谢酶的活性差异是影响齐多夫定治疗效果的主要因为。齐多夫定在体内主要由尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)代谢为5’-葡萄糖苷酸齐多夫定,该药约50~80%以此代谢产物的形式经肾脏清除。因此,本研究拟从UGT287*2和UGT287*1c基因多态性对齐多夫定药物代谢动力学影响的角度,阐明齐多夫定疗效个体差异的因为,进而为临床上使用齐多夫定治疗艾滋病提供个体化用药依据。
研究方法:
1.研究对象:
26名健康受试者,男15例,女11例,平均年龄23.31±1.74岁,平均体重62.00±5.79 kg,平均身高170.31±6.06 cm。经血尿常规、肝肾功能及心电图检查,各项检查指标均正常。本研究得到郑州大学第一附属医院伦理委员会批准,各受试者均自愿参加试验并于试验前由本人签署知情同意书。
2.试验方案:
受试者在试验前2周内未服用任何药物。服药前10 h禁食,服药后4 h进统一标准餐。晨起空腹口服300 mg齐多夫定片,用240 ml温开水送服,分别于给药前和给药后的0.167、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、4、5、8、10和12 h取静脉血5 ml,置EDTA抗凝试管中,1 h内离心和分离血浆,-70℃保存待测。
3.UGT287基因型分析:
采集受试者外周静脉血2 ml,用“酚-氯仿”法提取基因组DNA;采用PCR的方法扩增UGT287目的片段,PCR产物纯化后进行测序分析。根据UGT287*2基因型将受试者分3组:野生纯合子11例,杂合子10例和突变纯合子5例。UGT287*1c分两组:野生纯合子23例和突变杂合子3例,未发现突变纯合子。
4.齐多夫定血药浓度测定:
采用液质联用技术(LC-MS/MS)测定血浆中齐多夫定的浓度。色谱条件:色谱柱为C18柱(2.1×150mm,Keystone-Aquasil,5μm),流动相为乙腈:水=85:15,流速为0.3 ml/min,柱温30℃。质谱条件:离子源为ESI源,源电压5.0 KV;加热毛细管温度300℃;氮气(N2)流速30 ml/min;辅助气流速5ml/min;正离子方式检测;扫描方式为选择反应监测(SRM),齐多夫定和内标的m/z分别为265.9、268.9。样品处理:吸取醋酸铵250μl,加入250μl血浆样品和100μl内标溶液(齐多夫定-d3),涡旋混匀1 min后,将混合液加入超滤装置,3000×g离心30 min,取超滤液100μl进行LC-MS/MS分析。
5.统计学分析:
用3p97软件计算药动学参数。采用SPSS13.0统计软件处理数据;UGT287的基因型与各药动学参数间的比较采用方差分析或t检验。
结果:
1.齐多夫定血浆药物浓度测定的方法学考察:
齐多夫定药时数据按二室模型和权重系数为1/C2拟合度最好。标准曲线Y=0.0018x-0.0021,回归系数R2=0.9996,线性范围3-3000 ng/ml,最低检测限为3ng/ml;回收率平均97.4%,日内、日间变异波动范围<15%,样品稳定性良好。方法准确度、灵敏度、稳定性均符合生物样品分析要求。
2.UGT287*2对齐多夫定药动学参数的影响:
UGT287*2野生纯合子组血浆半衰期为0.325±0.256 h,突变杂合子组为0.228±0.216 h,突变纯合子组为0.644±0.383 h。突变纯合子组与野生纯合子、突变杂合子组相比血浆半衰期显著延长(P均<0.05)。达峰时间在UGT287*2野生纯合子、突变杂合子和突变纯合子组中分别为0.61±0.55 h,0.65±0.41 h和1.13±0.57h,具有延长趋势,但未达到显著性差异。清除率、峰浓度和曲线下面积在野生纯合子、突变杂合子和突变纯合子组分别为0.184±0.11 L/kg/h、0.13±0.14L/kg/h、0.24±0.18 L/kg/h:993.59±584.48 ng/ml、1709.954±1368.84 ng/ml、688.31±570.41 ng/ml:2020.14±780.12 ng*h/ml、2445.42±743.24 ng*h/ml、1723.28±1001.42 ng*h/ml;峰浓度在各基因组之间无显著差异。清除率,曲线下面积数据方差不齐,经对数转换后差异亦无显著性差异。
3.UGT287*lc对齐多夫定药动学参数的影响:
UGT287*1c野生纯合子组的半衰期、曲线下面积、清除率、峰浓度、达峰时间分别为0.33±0.30 h、2195.72±834.12 ng*h/ml、0.17±0.12 L/kg/h、1279.12±1052.50 ng/ml、0.69±0.52 h;突变杂合子组0.47±0.34 h、1596.86±618.40ng*h/ml、0.21+0.07L/kg/h、683.60±567.8 ng/ml、0.995±0.47 h。两基因型组间药动学参数无显著性差异。
结论:
1.UGT2B7*2突变纯合子能使齐多夫定在体内代谢减慢,半衰期延长。
2.UGT287*1c多态性与齐多夫定的药动学无发现显著差异。