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嘌呤受体分为P1和P2两大类。P1受体主要由A(腺苷)激活,P2受体主要由ATP等激活。P2受体主要又分为P2X和P2Y。P2X受体家族是一类对钾、钠和钙可通透的离子通道,P2Y受体家族是与G-蛋白相偶连的受体,与磷脂酶C的激活和肌醇三磷酸的形成有关。目前已克隆出7个不同的P2X亚型,分别称为P2X1-7,P2X7又称P2Z。P2X7受体特性与其他六个亚型不同;体外电生理实验表明ATP短暂刺激该受体可引起非选择性小阳离子瞬时通透;如果ATP反复或持续刺激该受体既可引起非选择性质膜孔道开放,最终导致细胞凋亡。虽然P2受体广泛地分布机体各组织器官,以往认为P2X7是唯一被证实分布于小胶质细胞的P2嘌呤受体。目前免役组织化学一般检测不出来,正常条件下免疫组织化学显示出的阳性细胞一般为神经细胞,而且比较浅淡。细胞外ATP可通过P2X受体可以激活胶质细胞。在体内,细胞外ATP浓度很低,不足以激活胶质细胞,表达更多的P2X受体。而细胞内ATP浓度较高,后者是前者的1000倍,达毫摩尔水平。在某些病理条件下如脑外伤、缺血、炎症等局部细胞受到损伤而释放出大量ATP及降解产物,它们在局部的浓度很高,而且会向邻近区域扩散,它们将较长时间地刺激损伤区和其邻近区的胶质细胞,这足以激活胶质细胞,并使其P2X受体表达上调。小胶质细胞激活后可肥大、增生,形成典型的吞噬细胞,可产生许多生物活性物质如活性氧、一氧化氮、蛋白酶及一些炎性物质对周围细胞产生损害作用;但另一方面又产生转化因子beta1和神经生长因子等物质促进神经组织再生及修复。活化的小胶质细胞在脑外伤、缺血、炎症、AIDS、多发性硬化病、蛋白病毒病、退行性病变如Alzheimer及Parkinson氏病以及衰老等过程中起很重要的作用。
尽管上述病理过程均与小胶质细胞活化有关,但小胶质细胞被激活的机制还不太清楚。综合本研究和以往文献资料,P2X7参与小胶质细胞的激活和凋亡效应。如果用特异性拮抗剂阻断ATP的作用,将阻止小胶质细胞和星形胶质细胞激活后所带来的对周围组织细胞的损害作用和胶质疤痕的形成,从而保护脑组织不受进一步的损害或有利神经纤维的再生。
本研究首先使用大鼠P2X7受体基因(GB号X95882)与EGFP基因融合构建了真核表达重组质粒pcDNA3-hi-EGFP-rP2X7。在此基础上,转染人HEK293细胞,使用G418作为筛选剂,在0.8mg/ml浓度下,经过单克隆化,建立了稳定表达P2X7受体和EGFP的HEK293细胞细胞株,经胞外ATP刺激的功能分析和免疫组织化学等测试,该细胞株正确表达P2X7受体并稳定传代50代以上。
我们使用上海生物芯片公司的人14k基因表达谱cDNA芯片(SHC-R-HC-100-20),分析了细胞外ATP在不同浓度和时间条件下,通过活化此转染细胞株后所导致的基因表达变异谱并使用RT-PCR等方法进行了进一步的验证。差异表达基因筛选标准为Ratio>=2或<=0.5,Flags为P,SN>2,除去质控点、不显著表达及无信号等数据点,在0.05mmol/LATP试验组中,有46个基因显著上调,而显著下调的有2个;0.1mmol/LATP试验组中,有35个基因显著上调,而显著下调的有1个;0.4mmol/LATP试验组中,有51个基因显著上调,而显著下调的有13个;0.8mmol/LATP试验组中,有93个基因显著上调,而显著下调的有8个。就基因显著表达的数量而言,总体上反映了随着胞外ATP浓度的增高,受P2X7受体介导,基因表达有活跃的趋势。表达显著下调的基因极少,胞外ATP所导致浓度计量效应极为明显。在挑选出的160个显著差异(含上调与下调)的基因中,基因受ATP浓度影响的趋势亦十分明显。
我们对其中的16条基因进行了RT-PCR验证,其中ATF3、BTG2、V-FOS、TGF1、HRK、BCL2、DUSP1、GADD45A、FBJ、STC2、SGK的结果与芯片的表达一致。这些基因涉及细胞周期、细胞凋亡、细胞信号转导等方面。其中大部分基因是首次发现与P2X7的调节显著相关。
在蛋白质组学方面,通过使用Ciphergen公司具有疏水反相性质的CM10蛋白质芯片,结合SELDI-TOF质谱分析,发现细胞外ATP在不同浓度下,通过P2X7受体活化的HEK293转染细胞株所导致的蛋白表达谱有明星的变异,经Biomark软件分析,0mmol/LATP试验组共有93个不同质荷比的峰值(P<0.1);0.1mmol/LATP试验组共有188个不同质荷比的峰值(P<0.1);0.8mmol/LATP试验组共有279个不同质荷比的峰值P<0.1)。从不同浓度试验组的峰值数量而言,随着胞外ATP逐渐增高,P2X7受体/HEK293细胞所表达的蛋白质数量有明显增多的趋势。
0.0mmol/LATP、0.10mmol/LATP和0.80mmol/LATP三个试验组中,随着胞外ATP的浓度增高,样品中M/Z值分别为3551.9、3939.1、4127.3、4282.1、5353.9、6272.3、6541.5的7个峰值出现明星的上升趋势(组间比较,P<0.02)。而0.0mmol/LATP、0.10mmol/LATP和0.80mmol/LATP三个试验组中,随着胞外ATP的浓度增高,样品中M/Z值分别为8175.2、8286.7、8659.3、8692.1的4个峰值出现明星的下降趋势(组间比较,P<0.01)。
本研究首次通过建立单独表达P2X7受体的单克隆细胞模型,分别在基因表达谱和蛋白质组水平对其诱导的表达特征进行了综合分析和验证,对发现的相关未知基因和蛋白功能的进一步研究有助于解释P2X7受体信号通路及其下游过程。