论文部分内容阅读
背景和目的:巨噬细胞作为先天免疫和组织修复中的关键免疫细胞,其所形成的泡沫细胞介导的慢性炎症应答在动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）发生发展过程中具有决定性作用。近期研究已证实由核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor3,NLRP3）/含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1,Caspase-1）/消皮素D（gasdermin D,GSDMD）介导的血管内膜下泡沫巨噬细胞焦亡在炎症性血管疾病—动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥着关键作用。因此,细胞焦亡可为AS的治疗提供新的靶点。硫化氢（hydrogen sulfide,H2S）是一种重要的内源性气体信号分子,已有大量研究证实了H2S的心血管保护、抗炎、抗AS和抗高血压作用。但目前关于H2S对AS发生发展过程中泡沫巨噬细胞焦亡的调控作用及其机制尚不清楚。因此,本研究拟采用氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL）刺激人单核巨噬细胞白血病细胞（human myeloid leukemia mononuclear cells,THP-1）分化的巨噬细胞建立体外细胞焦亡模型,明确H2S是否可通过抑制经典细胞焦亡通路而对AS致病危险因素ox-LDL诱导的巨噬细胞焦亡发挥抑制作用。方法:采用100 ng/mL佛波酯（Phorbol-12-myristate 13-acetate,PMA）刺激THP-1细胞24 h以诱导分化为巨噬细胞,之后采用ox-LDL、H2S供体及内源性H2S合成酶抑制剂干预THP-1巨噬细胞,并分为以下6组:（1）空白对照组;（2）D,L-炔丙基甘氨酸（D,L-propargylglycine,PAG）干预组;（3）ox-LDL刺激组;（4）ox-LDL+PAG干预组;（5）ox-LDL+Na HS干预组;（6）ox-LDL+PAG+Na HS干预组。采用CCK-8法评估Na HS/PAG对THP-1巨噬细胞活力的影响;采用油红O染色观察各组细胞脂质沉积情况;使用倒置显微镜观察各组细胞的焦亡形态学特征;采用Hoechst 33342/PI染色、LDH释放测定检测各组细胞中的细胞焦亡情况;采用亚甲基蓝法比色法检测各组细胞内的H2S含量;采用Caspase-1活性测定试剂盒检测各组细胞中的Caspase-1活性;采用ELISA检测THP-1巨噬细胞培养液上清中IL-1β、IL-18的水平。采用Western Blot检测各组细胞中细胞焦亡信号通路关键标志蛋白NLRP3、Pro-Caspase-1、Caspase-1（P20）、GSDMD、GSDMD-N、IL-18的表达。结果:（1）CCK-8细胞活性检测结果显示,与空白对照相比,NaHS（50、100、200、400μmol/L）对THP-1巨噬细胞无直接的毒性作用（P＜0.05或P＜0.01）;PAG（1、2.5、5、10mmol/L）均可使THP-1巨噬细胞活性显著降低（P＜0.05或P＜0.01）;（2）油红O染色结果显示,与空白对照组相比,100 mg/L ox-LDL可使THP-1巨噬细胞出现明显脂质沉积,而给予不同浓度Na HS预处理可明显减轻ox-LDL诱导的THP-1巨噬细胞脂质沉积;（3）各组细胞的焦亡形态学观察结果显示,与空白对照相比,ox-LDL组及ox-LDL+PAG联合干预可使THP-1巨噬细胞发生以细胞肿胀膨大及气泡状突出物为特点的细胞焦亡形态,而Na HS与ox-LDL/ox-LDL+PAG联合干预则可改善上述各组THP-1巨噬细胞的细胞焦亡形态;（4）Hoechst 33342/PI染色和LDH释放测定结果显示,与空白对照相比,低浓度ox-LDL（25和50 mg/L）对THP-1巨噬细胞中LDH释放无明显影响（P＞0.05）,而中、高浓度ox-LDL（100和150 mg/L）及ox-LDL+PAG联合处理则可使THP-1巨噬细胞的PI阳性染色细胞比例及LDH释放显著升高（P＜0.01）,而Na HS和ox-LDL/ox-LDL+PAG联合干预使PI阳性染色细胞比例和LDH释放显著减少（P＜0.01）;（5）H2S含量测定结果显示,与空白对照组相比,ox-LDL组及ox-LDL+PAG联合干预可使THP-1巨噬细胞中的H2S含量显著下降（P＜0.01）,而Na HS和ox-LDL组或ox-LDL+PAG联合干预则可显著提高THP-1巨噬细胞中的H2S含量（P＜0.05）;（6）Caspase-1活性测定结果显示,与空白对照相比,ox-LDL组及ox-LDL+PAG联合干预可使THP-1巨噬细胞中的Caspase-1活性显著升高（P＜0.01）,而Na HS与ox-LDL/ox-LDL+PAG联合干预则可显著降低THP-1巨噬细胞中的Caspase-1活性（P＜0.05或P＜0.01）;（7）ELISA测定结果显示,与空白对照组相比,ox-LDL组及ox-LDL+PAG联合干预可使THP-1巨噬细胞上清中的IL-1β、IL-18水平显著升高（P＜0.01）,而Na HS与ox-LDL/ox-LDL+PAG联合干预则可显著降低THP-1巨噬细胞培养液上清中的IL-1β、IL-18水平（P＜0.01）;（8）Western Blot结果显示,与空白对照相比,100mg/L或150 mg/L ox-LDL及ox-LDL+PAG联合处理可显著上调THP-1巨噬细胞中细胞焦亡关键标志蛋白NLRP3、Pro-Caspase-1、Caspase-1（P20）、GSDMD、GSDMD-N末端片段及IL-18的表达（P＜0.05或P＜0.01）;Na HS和ox-LDL/ox-LDL+PAG联合干预则可显著抑制ox-LDL或ox-LDL+PAG处理诱导的细胞焦亡关键蛋白的表达上调（P＜0.05或P＜0.01）。结论:H2S可通过作用于经典细胞焦亡信号通路,抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞焦亡。