第一部分：巨噬细胞吞噬骨髓来源间充质干细胞后的旁分泌作用对缺氧心肌细胞存活的影响及机制研究。目的：分析LPS活化的巨噬细胞与凋亡的骨髓间充质干细胞(dMSCs)共培养后,对缺氧心肌细胞的存活的影响。方法：从小鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,经缺氧盒诱导缺氧凋亡。巨噬细胞和凋亡的MSCs在有或无脂多糖(1微克／毫升)存在的情况下共同培养48小时,随后获取吞噬了dMSCs的巨噬细胞(pMΦ)；从新生小鼠获取的心肌细胞暴露于包括pMΦ在内的各种上清培养基中：MTT及线粒体膜电位检测试剂盒用于评估心肌细胞的活性。通过ELISA和实时PCR扩增检测巨噬细胞,骨髓间间充质干细胞以及pMΦ上清液中细胞因子和趋化因子(TNF-α,IFN-γ,IL-6,IL-12, PGE2,VEGF-α,Ang一1,KGF,IGF-1,PDGF-BB和EPO)水平；将磷酸盐缓冲液(阴性对照组)、MSCs(阳性对照组)、pMO(实验1组)、巨噬细胞炎性蛋白MIP-1α+pMΦ(实验2组)注射入急性心肌梗死(AMI)后BALB/C小鼠体内。应用磁共振及多光谱分析仪分析移植后细胞在梗死区的定植及强度。结果：活化的巨噬细胞能够有效吞噬dMSCs:和炎症的巨噬细胞相比,pMO表面的CD206表达明显下降(P<0.001),而CD86的膜表面抗原的表达显著升高(P<0.001)；pMΦ分泌TNF-α,IFN-γIL-12,IL-6等四种炎性细胞因子比活化的巨噬细胞明显减低(P<0.001)；pMΦ上清液中PGE2,VEGF-α,Ang-1,KGF,IGF-1,PDGF-BB和EPO水平显著增加。吞噬了dMSCs的巨噬细胞可改善缺氧心肌细胞的生存和存活时间,表现为线粒体膜电位显著增加(P<0.01)。与阴性对照组相比,阳性对照组、实验1组和实验2组的细胞均可定植于梗死心肌局部,4组的相对荧光强度分别为0.001±0.010、0.037±0.020、0.056±0.018和0.071±0.026(scaled counts/s):与阴性对照组比较,阳性对照组、实验1组和实验2组细胞移植治疗后小鼠的心肌梗死面积均显著缩小(P<0.001),实验1组的心肌梗死面积占左心室面积比例显著低于阳性对照组(P<0.001)；四组梗死区弹性纤维占梗死区瘢痕的比例分别为(0.97+1.04)%、(1.73±0.82)%、(4.90±1.31)%和(4.78±1.87)%,结论：pMΦ可提高缺氧心肌细胞生存能力和生存时间,可能与炎性细胞因子分泌减少以及生长因子的分泌增多相关；pMΦ可定植于梗死心肌并改善梗死后的心脏功能,其机制可能与其促进弹力纤维增生及细胞表面的抗原转化有关。第二部分：CD14++CD16+单核细胞加重心肌梗死及心肌梗死合并糖尿病患者急性心肌梗死后的心肌重塑目的：评估心肌梗死后CD14++CD16+单核细胞与心肌梗死及合并糖尿病心肌梗死患者的心肌重塑的相关性方法：随机入选67例ST段抬高心肌梗死合并糖尿病的患者及65例ST段抬高心肌梗死无糖尿病的患者。所有患者均在急性心肌梗死起病后12小时内接受心肌再灌注治疗。通过流式细胞仪分析患者入院后的单核细胞亚类；Q-PCR检测每一个单核细胞亚类的趋化因子D6受体mRNA水平；Elisa试剂盒分析患者血浆中CCL2水平；3D超声心动图检测所有患者心肌梗死后3天及6个月时间点的心肌梗死面积及左室射血分数；使用K-M生存分析模型来比较两组患者随访24个月时间内的再发心血管事件及死亡情况；使用Cox比例风险回归模型排除干扰因素后分析CD14++CD16+单核细胞与心肌梗死后无事件生存的相关性。结果：心肌梗死合并糖尿病患者急性心肌梗死后循环中CD14++CD16+单核细胞计数与心肌梗死后6个月时间的左室射血分数及心肌梗死面积呈显著相关(r=一0.32；p=0.008；r=0.57,p<0.001)；与无糖尿病心肌梗死患者相比,ST抬高心肌梗死合并糖尿病患者CD14++CD16+单核细胞表达更低的趋化因子诱饵D6受体(p<0.001)；ST抬高心肌梗死合并糖尿病患者血浆中CCL2水平更高(p<0.001).随后24个月时间的随访中ST抬高心肌梗死合并糖尿病患者中有23名患者发生再发心血管事件或者死亡,与无糖尿病心肌梗死患者中10名患者发生包含死亡在内的再发心血管事件；K-M生存分析模型提示CD14++CD16+单核细胞与ST抬高心肌梗死合并糖尿病患者的预后呈显著相关(p=0.010)； Cox比例风险回归模型排除干扰因素后进一步证实CD14++CD16+单核细胞与ST抬高心肌梗死合并糖尿病患者的再发心血管事件及死亡呈正相关(p=0.004,95% CI：1.62-12.49)。结论：CD14++CD16+单核细胞ST抬高心肌梗死合并糖尿病患者的心肌重塑呈显著相关性；CD14++CD16+单核细胞的计数与ST抬高心肌梗死合并糖尿病患者的预后显著相关；相关性可能与ST抬高心肌梗死合并糖尿病患者体内较高水平的CCL2以及CD14++CD16+单核细胞低表达D6受体有关。第三部分：急性心肌梗死后抑制Ly6Chigh单核细胞的动员可增强骨髓间充质干细胞的移植疗效以及受损心肌的修复目的：心肌梗死区域的炎症程度与MSCs移植后的存活息息相关,因此MSCs移植过程中控制急性心肌梗死后梗死区域的炎症显得尤其重要,本部分研究分析AMI后通过控制Ly6Chigh单核细胞的动员对MSCs移植疗效的影响。方法：实验组及对照组BALB/c急性心肌梗死模型小鼠分别皮下注射CCR2抑制剂(RS 504393,2 mg/kg)和等量生理盐水。随后同时向两组心肌梗死小鼠梗死心肌局部注射105 EdU-标记的MSCs。TUNEL染色试剂盒用来检测梗死区域心肌细胞的凋亡情况。麦胚凝集素染色梗死心肌切片用来检测梗死区域毛细血管密度,抗肌球蛋白重链eFluor 660染色用来检测心肌肌球蛋白阳性区域面积。细胞迁移小室用来检测]Ly6Chigh单核细胞和MSCs间的相互作用。ELISA试剂盒检测Ly6Chigh单核细胞炎症因子的分泌及MSCs分泌SDF-1水平。MTT法及线粒体膜电位检测试剂盒用来分析与Ly6Chigh单核细胞共培养后MSCs的细胞活性。结果：与对照组相比,心肌梗死3天后实验组(CCR2抑制剂组)小鼠心肌梗死区域移植MSCs的存活数量显著增多(11.2±3.4/mm2 vs.3.5±1.6/mm2,p<0.001),同时凋亡的心肌细胞数量显著减少(11.20%±3.55% vs.20.51%±8.17%,p<0.001)。MSCs移植后21天时可见实验组心肌梗死小鼠梗死区域小血管的数量(139.6±21.7/mm2vs.95.4±17.6/mm2,p<0.001)及心肌肌球蛋白阳性区域面积(17.90%±6.6% vs.11.8%±3.5% p<0.001)均较对照组显著增加,同时该时间点实验组小鼠的心脏功能(LvEF%)显著优于对照组(50.17±10.06 vs.45.44±9.45,p<0.001)。进一步研究分析发现与Ly6Chigh单核细胞共培养后MSCs的细胞线粒体膜电位(0.45±0.11 vs.3.4±0.3,p<0.001)及SDF-1分泌水平(80.77±39.02 pg/ml vs.435.5±77.41 pg/ml,p<0.001)显著减低。细胞因子检测提示Ly6Chigh单核细胞较Ly6Clow单核细胞分泌更多的炎症因子,包括IL-1(139.45±30.44 vs.80.05±19.33,p<0.001),IL-6(187.82±40.43 vs.135.5±22.09,p<0.001),TNF-a(121.77±31.65 vs.75.3±22.14,p<0.001)andIFN-y(142.46±27.55 vs.88.25±19.91,p<0.001).结论：急性心肌梗死后Ly6Chigh单核细胞的动员负向影响MSCs移植后的梗死区域营养效应,这可能与Ly6Chigh单核细胞分泌包括TNF-a,IL-1/6以及INF-y等较多的炎症因子减低了移植后MSCs的存活以及SDF-1的分泌有关。第四部分：光致发光介孔纳米载体荷载siCCR2抑制炎症性单核细胞迁移对心肌梗死后MSCs移植过程中MSCs移植疗效的影响背景：尽管在心肌梗死后的干细胞移植治疗中MSCs存在诸多优点,但是体内研究发现由于心肌梗死后局部剧烈的缺血、炎症反应,移植的MSCs仅能存活很短的时间。因此增强MSCs的存活及移植心肌重塑显得尤其重要,前一部分研究已提示CC-类趋化因子CCL2及其配体CCR2在心肌梗死后促进大量Ly6Chigh单核细胞浸润到梗死心肌局部影响MSCs的移植疗效。因此采取减少Ly6Chigh单核细胞在心肌梗死后浸润到梗死心肌局将有益于心肌梗死患者心肌的修复。目的：该部分研究通过使用荷载si-RNA的荧光介孔硅纳米载体(PMSNs)靶向干预Ly6Chigh单核细胞的CCR2受体以期减少心肌梗死后梗死心肌局部Ly6Chigh单核细胞的浸润,从而提升MSCs的移植疗效并减轻心肌重塑。方法：首先物理合成荷载siCCR2的PMSNs-siCCR2纳米荷载颗粒,BALB/c小鼠心肌梗死模型制作成功后,100ul PBS中105EdU标记的MSCs通过心肌局部注射的方式注射到梗死心肌局部。同时PMSNs-siCCR2颗粒(25 gg/g)通过尾静脉迅速注射入小鼠体内,对照组心肌梗死小鼠仅注射等量的PMSNs纳米颗粒。通过近红外成像技术观测PMSNs-siCCR2纳米荷载颗粒在体内的代谢及分布,最后分别在RNA、蛋白及功能水平分析PMSNs-siCCR2干预情况下MSCs的移植治疗效应。结果：PMSNs-siCCR2荷载纳米颗粒可在体内随着循环自由流通,半衰期约37min同时未提示毒性证据。治疗性的PMSNs-siCCR2纳米颗粒容易富集到脾脏及循环Ly6Chigh单核细胞,与对照组相比PMSNs-siCCR2纳米颗粒可有效的降解CCR2受体(8.04%±2.17% vs.20.02%±4.55%,p<0.001).随后发现心肌梗死后第一天PMSNs-siCCR2显著减少了CD11b阳性单核细胞在梗死区的聚集(49.3%±17.34%vs.61.32%±22.43%,p<0.001)。与对照组相比心肌梗死后第三天PMSNs-siCCR2组移植存活的MSCs显著增多(13±3/mm2 vs.4±1/mm2,p<0.001)同时梗死区域TUNEL+心肌细胞明显减少(17.44%±6.26% vs.39.49%±13.28%,p<0.001)。三周后PMSNs-siCCR2组心肌梗死区域毛细血管密度(235.5±39.6/mm2 vs.147.4±20.3/mm2,p<0.001)以及肌球蛋白重链面积比例(21.7%±8.4% vs.13.2%±4.4%,p<0.001)显著增加,同时该组小鼠的心肌重塑(左室后壁厚度)显著优于对照组(0.84±0.11 mm vs.0.61±0.08 mm,p<0.001)。结论：PMSNs-siCCR2介导的Ly6Chigh单核细胞内CCR2的基因沉默显著增强了MSCs的移植疗效,有效降低了心肌梗死后的心肌重塑,这些结果表明PMSNs-siCCR2纳米颗粒可有效的控制心肌梗死后MSCs移植过程中的炎症反应。