【摘 要】
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目的周围神经损伤是由于各种原因引起的并在该神经所支配的范围内出现了诸多方面的障碍。NLRP3可检测到各种微生物基序和内源性危险信号,从而导致炎性小体的形成。本课题研究使用NLRP3基因敲除小鼠来构建外周神经损伤模型,旨在更深一步的探索NLRP3炎性小体是否参与外周神经损伤疾病,及其在外周神经损伤后的修复中的作用,为更好的探索外周神经损伤及修复机制奠定实验基础。方法本研究选用C57BL/6野生型小鼠
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目的周围神经损伤是由于各种原因引起的并在该神经所支配的范围内出现了诸多方面的障碍。NLRP3可检测到各种微生物基序和内源性危险信号,从而导致炎性小体的形成。本课题研究使用NLRP3基因敲除小鼠来构建外周神经损伤模型,旨在更深一步的探索NLRP3炎性小体是否参与外周神经损伤疾病,及其在外周神经损伤后的修复中的作用,为更好的探索外周神经损伤及修复机制奠定实验基础。方法本研究选用C57BL/6野生型小鼠（WT）,NLRP3基因敲除小鼠(Nlrp3-/-)和TLR4基因敲除小鼠(Tlr4-/-)。按照以下步骤进行:1、构建外周神经钳夹伤的动物模型。采用抽签的方式将WT小鼠随机的分为对照组（42只）,钳夹伤组（60只）;Nlrp3-/-小鼠随机分为对照组（12只）,钳夹伤组（48只）及Tlr4-/-小鼠钳夹伤组（3只）。小鼠麻醉后,对照组仅暴露出坐骨神经60秒（s）;钳夹伤组暴露出坐骨神经并用止血钳夹伤60s。2、检测NLRP3炎性小体。利用HE和LFB染色检测坐骨神经的炎症与髓鞘变化情况。利用RT-qPCR方法检测NLRP3,Caspase-1,ASC,IL-18和IL-1β因子在基因水平的变化。利用Western blot方法检测NLRP3,Caspase-1,ASC,IL-18和IL-1β在蛋白水平的变化。利用免疫荧光法检测ASC寡聚成核的情况以及巨噬细胞浸润情况。3、检测WT小鼠与Nlrp3-/-小鼠坐骨神经损伤后的恢复情况。利用Western blot方法于1周（w）检测p75NTR和GAP-43的蛋白表达。利用免疫组化法于2 w和3 w检测p75NTR和GAP-43的蛋白表达情况。利用坐骨神经功能指数（SFI,Sciatic nerve function index）来评价小鼠运动功能方面的恢复情况。4、利用Western blot方法检测TLR4参与调控NLRP3产生情况。结果构建小鼠的外周坐骨神经钳夹伤损伤模型成功。（1）WT小鼠检测结果:相比对照组,LFB染色结果表明钳夹伤组髓鞘结构不完整且发生脱髓鞘。HE染色结果表明钳夹伤组炎症细胞增多。RT-qPCR结果表明,NLRP3和IL-1β的m RNA水平在钳夹伤组显著升高（P<0.0001）;Western blot结果表明,Caspase-1和ASC的蛋白水平在钳夹伤组显著升高（P<0.01）,而NLRP3和IL-1β的蛋白水平在神经损伤后24 h显著升高（P<0.01）;免疫荧光分析,钳夹伤组ASC斑点的数量显著升高（P<0.01）。（2）Nlrp3-/-小鼠检测结果:相比对照组,LFB和HE染色结果与WT钳夹伤组相同;与此同时,免疫荧光检测发现,与Nlrp3-/-小鼠钳夹伤组相比,WT小鼠钳夹伤组CD68+巨噬细胞数量更多;RT-qPCR结果表明,相比WT小鼠钳夹伤组,在坐骨神经损伤后所测定时间点,NLRP3和IL-1β的m RNA水平在Nlrp3-/-小鼠钳夹伤组显著降低（P<0.0001）,神经损伤后24 h和48 h,ASC和Caspase-1的m RNA水平在Nlrp3-/-小鼠钳夹伤组显著降低（P<0.001）;Western blot结果表明,相比WT小鼠钳夹伤组,坐骨神经损伤后12h和24h,NLRP3、IL-18和IL-1β的蛋白水平,在Nlrp3-/-小鼠钳夹伤组中显著降低（P<0.01）,神经损伤后24 h,ASC和Caspase-1的蛋白水平,在Nlrp3-/-小鼠钳夹伤组中显著降低（P<0.01）。（3）神经损伤后的修复结果:Western blot方法和免疫组化方法结果都表明,相比WT小鼠钳夹伤组,p75NTR和GAP-43的蛋白水平在Nlrp3-/-小鼠钳夹伤组中增高。SFI的结果显示,相比WT小鼠钳夹伤组,SFI的评分在Nlrp3-/-小鼠钳夹伤组中增高。（4）TLR4调控NLRP3的表达结果:Western blot检测结果,与WT小鼠钳夹伤组相比,NLRP3、NF-κB和TLR4的蛋白水平在Tlr4-/-小鼠钳夹伤组中表达减少。结论成功构建三种实验小鼠的坐骨神经钳夹伤模型。坐骨神经损伤后可引起NLRP3炎性小体的形成并进一步被激活;并且TLR4在一定程度上正向调控了NLRP3的形成。此外,敲除NLRP3基因可减弱神经损伤后的炎症反应,加快坐骨神经的运动功能的恢复。本研究,为外周神经损伤的炎症发生机制提供了理论依据,为临床治疗外周神经损伤及功能恢复提供了新的线索。
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