乙酰胆碱在许多非神经系统的发现引出了“非神经胆碱能系统”的概念。在人类的许多组织上证明有该系统的存在，诸如免疫活性细胞、上皮细胞及肉皮细胞。而乙酰胆碱内皮细胞靶标(endothelial target for acetylcholine,ETA)作为非神经性胆碱能系统在内皮细胞上的作用靶标引起国内外学者的广泛注意，ACh激活ETA诱发的内皮依赖性舒张血管反应早已成为判断内皮功能完整的金指标，并且与动脉粥样硬化等内皮源性心血管疾病的发生发展密切相关。本研究室在动物模型上的药效学实验已确证拮抗ETA具有明确的损伤内皮细胞及血管平滑肌的作用，而激活ETA能够有效的延缓动脉粥样硬化的发展及血栓形成。因此，ETA作为血管内皮细胞药物靶标具有良好的抗动脉粥样硬化和抗血栓应用前景，认识其生物学本质对开发新型的治疗心血管疾病的药物具有重要的指导意义。 目前，关于ETA受体类型的研究存在许多争议，因其可被乙酰胆碱激活，被阿托品拮抗，有些学者将其列为M受体；有些学者认为ETA与M受体在激动剂及拮抗剂的选择性上有不同之处。至今除确定ETA为G蛋白偶连受体、内皮细胞钙离子是ETA激活的一个信使物质外，对ETA激活后的信号转导途径及确切机制知之甚少；另外分子生物学南京医科大学硕士学位论文研究也未得出一致结论。 本研究通过对人膝静脉上内皮依赖性舒张反应及其M受体基因表达的研究，将药理学特征与分子物生物学的研究结合，进一步分析ETA与M受体间的关系。而另一方面，应用高分辫率的双向电泳技术、质谱技术及生物信息学技术，筛选鉴定ETA激动剂作用前后人冠状动脉内皮细胞表达的蛋白的变化，以期发现与ETA信号转导机制相关线索，并从分子生物学上揭示ETA受体本质。一、ETA不同于经典m受体 对于乙酞胆碱诱发的内皮依赖性舒张反应过程中，乙酞胆碱作用的内皮细胞靶受体尚无定论。由于阿托品可以拮抗ACh诱发的内皮依赖性舒张反应，一直以来，m受体被认为是ACh作用的靶点;而另有一些学者提出乙酞胆碱的内皮靶标不同于经典的m受体。人的脐静脉内皮细胞(HuvEC)是较为常用的研究内皮细胞功能的模型，而有研究表明ACh不能诱发出人脐静脉的内皮依赖性舒张反应。本研究以人的脐静脉为模型，采用离体血管环的方法，观察ACh及其他血管活性药物对膝静脉内皮依赖性舒张反应的影响，以明确膝静脉上是否存在ETA;另一方面，通过RT-PCR检测HUVEC上表达的m受体的基因亚型，并给予m受体激动剂及拮抗剂，采用激光共聚焦技术检测胞内钙的改变来观察膝静脉内皮细胞上是否有功能性m受体的表达，进而为阐明乙酞胆碱诱发的内皮依赖性舒张反应与m受体间可能的关系提供实验依据。结果表明 1.在5一HT(10一7mol.L一’)预收缩平衡的内皮完整的脐静脉血管环上， Ach(l0一几10一，mol.L一’)不能诱发血管的内皮依赖性舒张反应。 2.在10一7mol.L一’5一HT预收缩平衡的内皮完整的脐静脉血管环上， ATPlo一’mol .L一’可以诱发用的血管的内皮依赖性舒张反应。 3.在事先给予NO合成酶抑制剂L一NAME 10一4mol.L一’预孵30min 后，ATP诱发的血管环舒张反应可以被抑制。表明NO对ATP 诱发的血管舒张反应起重要作用，脐静脉血管内皮上NO的合 成及释放环节是通畅的。ACh不能诱发脐静脉内皮依赖性舒张南京医科大学硕士学位论文反应可局限于脐静脉上缺少其作用的靶受体。RT-PCR结果显示HUVEC上表达所有的Ml一MS受体基因亚型。我室前期研究表明Pilocarpine不激活ETA，但可激活M受体，而Carbachol是两者共同的激动剂，我有]给予Carbachol及Pilocarpine刺激后，结果显示两者均可增加相应受体亚型的基因表达量，并且两者的作用无显著差异。此结果说明HUVEC上可能无ETA基因，ETA不同于经典m受体。激光共聚焦检测m受体激动剂及桔抗剂对HUVEC胞内钙([ ca勺1助影响，发现用M受体激动剂诱发出阿托品敏感性的一过性[C a2+〕i升高。此结果与上一点共同说明HuvEc上表达的m受体是功能性的。二、乙酞胆碱作用于人冠状动脉内皮细胞前后差异蛋白的分析 尽管ETA诱发的胞内反应信号传导途径已较为明晰，而且其介导的内皮依赖性舒张反应早已成为检验内皮细胞功能的经典指标，但近20年的研究仍未能确定该受体为何种蛋白。 新兴的高通量筛选技术使得对组织或细胞差异基因及蛋白质的综合分析成为可能。目前，蛋白质组学研究技术包括高分辫率的双向电泳及质谱技术已应用于药物靶分子的寻找和分析中。在培养的血管内皮细胞上给予ETA激动剂激活ETA的表达后，通过比较给药前后血管内皮细胞蛋白的表达差异，有可能发现ETA相关蛋白。 本研究在对内皮细胞进行形态学、内皮细胞标志物VllI因子相关抗原免疫组化鉴定以及ETA对内皮细胞胞内钙离子调节功能测定的基础上，应用高分辫率的双向电泳技术、质谱技术及生物信息学等技术，筛选鉴定激活ETA前后内皮细胞表达的差异蛋白。1.10代以内的人冠状动脉内皮细胞在倒置显微镜下均呈铺路石排 列，标志物VlII因子相关抗原免疫组化鉴定均呈阳性;因为内皮细胞 内钙