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目的:
Kinectin是内质网结合蛋白，是动力蛋白Kinesin的受体，与整合素、阳lOG蛋白以及蛋白质翻译延伸因子有着密切的关系，本课题组前期首先通过SEREX方法证实Kinectin是肝癌相关抗原。Kinectin基因在肝癌组织有4个选择剪接区D1-D4，但只有D2与D3位于开放阅读框(Open readingframe , ORF)内，NCBI上的Kinectin的相关信息显示Kinectin存在4个转录本，在选择性剪接过程中可能产生3种Kinectin蛋白质异构体，即D2-n3+,D2+n3-,D2-D3+。课题组前期通过逆转录聚合酶链式扩增反应(Reverse Transcription-Polmerase Chain Reaction, RT-PCR)发现Kinectin保守区mRNA的表达水平在肝癌、癌旁和正常肝组织并无显著差异，而D2LID2S(D2L表示PCR产物长片段、含D2区;D2s表示PCR产物短片段、不含D2区)的mRNA比值在肝癌组织显著高于癌旁组织和正常肝组织，提示含D2剪接区Kinetin异构体可能参与肝癌的发生发展，因此本研究的目的是阐明含D2剪接区Kinectin异构体在肝癌中可能发挥的作用，为肝癌发生发展机制的研究提供新的切入点，同时也为将本课题组最先报告的肝癌相关抗原Kinectin应用于肝癌临床诊断和治疗提供新的基础资料。
方法:
1.制备KinectinD2剪接区多克隆抗体，免疫组化检测KinectinD2蛋白与阳nectin保守区蛋白在人肝癌与配对癌旁组织的表达，从蛋白水平比较KinectinD2在肝癌与癌旁的表达情况。
2.构建三个重组慢病毒载体(Lentivirus ， LV ):LV5-KinectinD2+、LV5-KinectinD2-和LV5NC(Negativecontrol，阴性对照)，LV5-KinectinD2+含KinectinD2剪切区，LV5-KinectinD2-不含KinectinD2剪切区，LV5NC为阴性对照:分别转染入包装细胞293T(人肾上皮细胞)，收集病毒液测定病毒滴度。
3.分别将LV5-K且ectinD2+、LV5-KinectinD2-、LV5NC转染肝癌细胞，确定最佳病毒复数MOI值(Multiply of infection, MOI);嘿岭霉素筛选出稳定转染后细胞株HepG2/LV5-Kinec位:tD2+、HepG2/LV5-K坦ectinD2-、HepG2/LV5NC。
4.比较三组转染肝癌细胞生物学行为:CCK8检测细胞增殖情况、克隆形成实验检测细胞克隆形成能力、流式细胞仪检测细胞周期、流式细胞仪检测细胞凋亡、划痕修复实验与Transwell实验检测细胞迁移能力。
5.分别将HepG2/LV5-KinectinD2+、HepG2/LV5-KinectinD2-、HepG2/LV5NC细胞注射裸鼠体内成瘤，比较三组裸鼠体重变化及皮下瘤肿瘤生长变化。
结果:
1.免疫组化检测结果显示阻nectinD2蛋白在肝癌组织的总光密度值(IOD)75142±16663明显高于配对癌旁组织54079±10825，肝癌组织的平均光密度值(MOD)0.09518土0.013明显高于配对癌旁组织0.0777±0.011，差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.免疫组化检测结果显示Kinectin保守区蛋白在肝癌组织的总光密度值(IOD)76320土15904明显高于配对癌旁组织57897±14877，肝癌组织的平均光密度值(MOD)0.0982±0.017明显高于配对癌旁组织0.0819±0.015，差异有统计学意义(P＜0.05)。
3.转染肝癌细胞LV5-K.inectinD2+、LV5-KinectinD2-、LV5NC的最佳MOI值分别为100、70、70;获得稳定转染细胞株HepG2/LV5-KinectinD2+、HepG2/LV5-KinectinD2-、HepG2/LV5NC。
4.CCK-8法检测细胞增值结果显示，HepG2/LV5-K.inectinD2+组细胞的增值率2.823±0.256高于HepG2/LV5-KinectinD2-组2.349±0.076和HepG2/LV5NC组2.232±0.093(P＜0.05);克隆形成实验结果显示HepG2/LV5-KinectinD2+组细胞的克隆形成率57.00±3.61明显高于HepG2/LV5-KinectinD2-组48.66±5.11和HepG2/LV5NC组40.33±3.21(P＜0.05)。
5.流式细胞仪检测细胞周期结果显示，HepG2/LV5-KinectinD2+组DNA合成前期(G1期)所占百分比56.973±3.587明显低于与HepG2/LV5-KinectinD2-组66.070±2.099和HepG2/LV5NC组77.850±1.515细胞(P＜0.05),HepG2/LV5-KinectinD2+组DNA合成期(S期)所占百分比25.547±1.638明显高于HepG2/LV5-K.inectinD2-组20.120±3.852和HepG2/LV5NC组17.223±2.140细胞(P＜O.05)。
6.流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示HepG2/LV5-KinectinD2+组细胞凋亡细胞所占百分比24.633±1.931明显低于HepG2/LV5-KinectinD2-组31.493±0.791与HepG2/LV5NC组32.793±1.068细胞(P＜0.05)。
7.划痕修复实验结果显示HepG2/LV5-KinectinD2+组细胞迁移28.667±8.327与HepG2/LV5-KinectinD2-组26.343±8.505与HepG2/LV5NC组23.333±7.095，差异无统计学差异(P＞0.05);Transwell实验结果显示HepG2/LV5-KinectinD2+组细胞穿膜细胞数51.010±7.937、与HepG2/LV5-KinectinD2-组48.667±5.859与、HepG2/LV5NC组41.001±6.557，差异无统计学意义(P＞0.05)。
8.裸鼠皮下瘤体积(mm3 )变化结果显示，第1周至第4周HepG2/LV5-KinectinD2+组裸鼠皮下瘤体积(57.300±34.59/1w,198.870±106.92/2w,650.97±142.97/3w，966.14±225.53/4w)均大于HepG2/LV5-KinectinD2-组(30.300±31.66/1w，63.701±29.12/2w，440.93±272.33/3w，559.06±239.59/4w)和HepG2/LV5NC组(23.563±30.34/1w，49.736±51.02/2w，350.76±192.64/3w，406.45±322.73/4w)裸鼠皮下瘤体积(P＜0.05)。
9.裸鼠体重(g)变化结果显示，在1-2周体重上升，3周以后均出现体重下降，第4周HepG2/LV5-KinectinD2+组裸鼠体重17.938±1.891低于HepG2/LV5NC组裸鼠体重19.000±0.927(P＜0.05)。其余各时间点体重变化差异无统计学意义(P＞0.05)。
结论:
1.KinectinD2蛋白与Kinectin保守区蛋白在肝癌组织的表达均高于癌旁组织。
2.含D2剪切区Kinectin异构体能促进细胞增殖，促进细胞从DNA合成前期(G1期)进入DNA合成期(S期)，抑制细胞凋亡，对细胞迁移无明显影响。
3.含D2剪切区Kinectin异构体促进裸鼠皮下瘤的发生。
4.含D2剪切区Kinectin异构体与肝癌发生发展有关。
Kinectin是内质网结合蛋白，是动力蛋白Kinesin的受体，与整合素、阳lOG蛋白以及蛋白质翻译延伸因子有着密切的关系，本课题组前期首先通过SEREX方法证实Kinectin是肝癌相关抗原。Kinectin基因在肝癌组织有4个选择剪接区D1-D4，但只有D2与D3位于开放阅读框(Open readingframe , ORF)内，NCBI上的Kinectin的相关信息显示Kinectin存在4个转录本，在选择性剪接过程中可能产生3种Kinectin蛋白质异构体，即D2-n3+,D2+n3-,D2-D3+。课题组前期通过逆转录聚合酶链式扩增反应(Reverse Transcription-Polmerase Chain Reaction, RT-PCR)发现Kinectin保守区mRNA的表达水平在肝癌、癌旁和正常肝组织并无显著差异，而D2LID2S(D2L表示PCR产物长片段、含D2区;D2s表示PCR产物短片段、不含D2区)的mRNA比值在肝癌组织显著高于癌旁组织和正常肝组织，提示含D2剪接区Kinetin异构体可能参与肝癌的发生发展，因此本研究的目的是阐明含D2剪接区Kinectin异构体在肝癌中可能发挥的作用，为肝癌发生发展机制的研究提供新的切入点，同时也为将本课题组最先报告的肝癌相关抗原Kinectin应用于肝癌临床诊断和治疗提供新的基础资料。
方法:
1.制备KinectinD2剪接区多克隆抗体，免疫组化检测KinectinD2蛋白与阳nectin保守区蛋白在人肝癌与配对癌旁组织的表达，从蛋白水平比较KinectinD2在肝癌与癌旁的表达情况。
2.构建三个重组慢病毒载体(Lentivirus ， LV ):LV5-KinectinD2+、LV5-KinectinD2-和LV5NC(Negativecontrol，阴性对照)，LV5-KinectinD2+含KinectinD2剪切区，LV5-KinectinD2-不含KinectinD2剪切区，LV5NC为阴性对照:分别转染入包装细胞293T(人肾上皮细胞)，收集病毒液测定病毒滴度。
3.分别将LV5-K且ectinD2+、LV5-KinectinD2-、LV5NC转染肝癌细胞，确定最佳病毒复数MOI值(Multiply of infection, MOI);嘿岭霉素筛选出稳定转染后细胞株HepG2/LV5-Kinec位:tD2+、HepG2/LV5-K坦ectinD2-、HepG2/LV5NC。
4.比较三组转染肝癌细胞生物学行为:CCK8检测细胞增殖情况、克隆形成实验检测细胞克隆形成能力、流式细胞仪检测细胞周期、流式细胞仪检测细胞凋亡、划痕修复实验与Transwell实验检测细胞迁移能力。
5.分别将HepG2/LV5-KinectinD2+、HepG2/LV5-KinectinD2-、HepG2/LV5NC细胞注射裸鼠体内成瘤，比较三组裸鼠体重变化及皮下瘤肿瘤生长变化。
结果:
1.免疫组化检测结果显示阻nectinD2蛋白在肝癌组织的总光密度值(IOD)75142±16663明显高于配对癌旁组织54079±10825，肝癌组织的平均光密度值(MOD)0.09518土0.013明显高于配对癌旁组织0.0777±0.011，差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.免疫组化检测结果显示Kinectin保守区蛋白在肝癌组织的总光密度值(IOD)76320土15904明显高于配对癌旁组织57897±14877，肝癌组织的平均光密度值(MOD)0.0982±0.017明显高于配对癌旁组织0.0819±0.015，差异有统计学意义(P＜0.05)。
3.转染肝癌细胞LV5-K.inectinD2+、LV5-KinectinD2-、LV5NC的最佳MOI值分别为100、70、70;获得稳定转染细胞株HepG2/LV5-KinectinD2+、HepG2/LV5-KinectinD2-、HepG2/LV5NC。
4.CCK-8法检测细胞增值结果显示，HepG2/LV5-K.inectinD2+组细胞的增值率2.823±0.256高于HepG2/LV5-KinectinD2-组2.349±0.076和HepG2/LV5NC组2.232±0.093(P＜0.05);克隆形成实验结果显示HepG2/LV5-KinectinD2+组细胞的克隆形成率57.00±3.61明显高于HepG2/LV5-KinectinD2-组48.66±5.11和HepG2/LV5NC组40.33±3.21(P＜0.05)。
5.流式细胞仪检测细胞周期结果显示，HepG2/LV5-KinectinD2+组DNA合成前期(G1期)所占百分比56.973±3.587明显低于与HepG2/LV5-KinectinD2-组66.070±2.099和HepG2/LV5NC组77.850±1.515细胞(P＜0.05),HepG2/LV5-KinectinD2+组DNA合成期(S期)所占百分比25.547±1.638明显高于HepG2/LV5-K.inectinD2-组20.120±3.852和HepG2/LV5NC组17.223±2.140细胞(P＜O.05)。
6.流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示HepG2/LV5-KinectinD2+组细胞凋亡细胞所占百分比24.633±1.931明显低于HepG2/LV5-KinectinD2-组31.493±0.791与HepG2/LV5NC组32.793±1.068细胞(P＜0.05)。
7.划痕修复实验结果显示HepG2/LV5-KinectinD2+组细胞迁移28.667±8.327与HepG2/LV5-KinectinD2-组26.343±8.505与HepG2/LV5NC组23.333±7.095，差异无统计学差异(P＞0.05);Transwell实验结果显示HepG2/LV5-KinectinD2+组细胞穿膜细胞数51.010±7.937、与HepG2/LV5-KinectinD2-组48.667±5.859与、HepG2/LV5NC组41.001±6.557，差异无统计学意义(P＞0.05)。
8.裸鼠皮下瘤体积(mm3 )变化结果显示，第1周至第4周HepG2/LV5-KinectinD2+组裸鼠皮下瘤体积(57.300±34.59/1w,198.870±106.92/2w,650.97±142.97/3w，966.14±225.53/4w)均大于HepG2/LV5-KinectinD2-组(30.300±31.66/1w，63.701±29.12/2w，440.93±272.33/3w，559.06±239.59/4w)和HepG2/LV5NC组(23.563±30.34/1w，49.736±51.02/2w，350.76±192.64/3w，406.45±322.73/4w)裸鼠皮下瘤体积(P＜0.05)。
9.裸鼠体重(g)变化结果显示，在1-2周体重上升，3周以后均出现体重下降，第4周HepG2/LV5-KinectinD2+组裸鼠体重17.938±1.891低于HepG2/LV5NC组裸鼠体重19.000±0.927(P＜0.05)。其余各时间点体重变化差异无统计学意义(P＞0.05)。
结论:
1.KinectinD2蛋白与Kinectin保守区蛋白在肝癌组织的表达均高于癌旁组织。
2.含D2剪切区Kinectin异构体能促进细胞增殖，促进细胞从DNA合成前期(G1期)进入DNA合成期(S期)，抑制细胞凋亡，对细胞迁移无明显影响。
3.含D2剪切区Kinectin异构体促进裸鼠皮下瘤的发生。
4.含D2剪切区Kinectin异构体与肝癌发生发展有关。