背景:孢子丝菌病（sporotrichosis）是由申克孢子丝菌复合体引起的慢性肉芽肿性真菌感染性疾病,多见于暴露部位,如面部、颈部及四肢等。孢子丝菌病可累及皮肤粘膜、皮下组织、局部淋巴结及深部脏器。申克孢子丝菌是一种双相病原菌,存在形式为酵母态或菌丝态。全球范围内几乎都存在孢子丝菌病的分布,此病病程长危害大。其临床过程通常为:致病菌通过破损的皮肤或黏膜侵入,沿淋巴管移行,导致病变处皮下结节、化脓、破溃、渗出及肉芽肿等病变。还有极少数患者因吸入孢子丝菌而导致肺部孢子丝菌感染。对于免疫功能低下的个体,孢子丝菌病原菌可能经血播散至中枢神经及内脏,引起全身系统性感染,可能危及生命。目前该病治疗方法有限,主要由碘化钾疗法,抗真菌药物等。此病治疗时间较长,且因患病人群多为贫困山区人群,用药不规律,易引起疾病迁延不愈,因此探究孢子丝菌病的免疫过程,因而找到针对此病的较有效的治疗方法,非常重要。机体抵抗孢子丝菌的机制主要包括天然免疫和适应性免疫。机体的天然屏障（完整的皮肤黏膜,有效抵抗外来抗原对机体的入侵）、免疫细胞和免疫因子构成了天然免疫。巨噬细胞、中性粒细胞以及树突状细胞这三种固有免疫细胞是机体的固有免疫系统抵抗真菌的主要细胞成分;各种提高免疫细胞杀伤作用或直接作用于外来抗原的细胞因子、一氧化氮等称为免疫因子,免疫因子同样在机体抵抗真菌过程中发挥重要作用。天然免疫细胞因其强大的初期抵抗外来抗原入侵机体的特征,是抗孢子丝菌免疫的主力。孢子丝菌病皮损的病理学检查中一般可见“三区”现象,三区现象中最内层为大量中性粒细胞浸润,因为中性粒细胞是感染最初期（24h内）最早产生效应的固有免疫细胞。但是中性粒细胞对孢子丝菌杀伤力非常有限。而树突状细胞的主要功能是向淋巴细胞抗原提成,在整体固有免疫系统中杀灭孢子丝菌过程中发挥的作用较弱。在机体抗孢子丝菌免疫过程中,获得性免疫同样发挥了重要作用,支持这一观点的重要的证据为:当严重获得性免疫缺陷的HIV感染者感染孢子丝菌病后,通常不再仅仅表现为皮肤型,而常常发展为播散型孢子丝菌病,且严重获得性免疫缺陷患者感染播散型孢子丝菌病后,对各种治疗方法均反应不佳。巨噬细胞具有强大的吞噬杀伤能力和较强的抗原呈递功能,是固有免疫和适应性免疫的桥梁,是机体抵抗孢子丝菌的核心。但被巨噬细胞吞噬的孢子丝菌,仍可部分保持结构完整甚至出芽繁殖的能力,这反而成为孢子丝菌并免受其他免疫机制的攻击并导致疾病迁延不愈的重要原因,因此探究如何提升巨噬细胞杀灭胞内孢子丝菌的能力极为重要。以往的观点认为温热疗法的机制为杀灭病灶中的孢子丝菌,但也有研究指出短时间内的41℃的温热对孢子丝菌生长几乎无影响。所以,局部温热治疗孢子丝菌的机制还可能为温热提高机体抗孢子丝菌的免疫,从而促进真菌的杀灭。内质网钙库紧张可激活细胞膜上钙离子通道,介导细胞外Ca²⁺内流,此过程称为钙库操作性钙离子通道（store-operated calcium entry,SOCE）。Orai1和STIM1是SOCE的两个最主要的组成分子,Orai 1是位于胞内细胞膜下的一种可构成钙离子通道的蛋白分子,STIM1则位于内质网上,STIM1可以感受内质网中Ca²⁺的含量的多少,当内质网中钙离子浓度降低,STIM 1可被激活从而导致Orai 1通道打开,Ca²⁺内流,调节细胞的生理病理过程。由STIM1蛋白激活介导Orai1通道开放导致的细胞钙内流的通道称为细胞储量调控Ca²⁺离子释放激活Ca²⁺离子（CRAC）通道。对于包括各种免疫细胞在内的非兴奋型细胞,钙内流的最主要方式是通过CRAC钙通道的钙内流。CRAC钙通道的关键启动蛋白STIM1,因其掌管包括各种免疫细胞在内的几乎全部非兴奋细胞的钙离子通道开放与否,所以参与调控淋巴细胞,肥大细胞,吞噬细胞等多种免疫细胞的钙通道开放,从而参与调控各免疫细胞的功能状态。钙离子内流通常预示着免疫细胞的激活,当外界抗原抗原刺激各种免疫细胞时,抗原表面的各型配体与免疫细胞表面的免疫受体、G蛋白耦联受体等细胞膜表面迅速结合,导致磷脂酶C（PLC）活化,接着磷酯酰肌醇二磷酸（PIP2）水解,水解的PIP2可产生三磷酸肌醇（IP3）,IP3与免疫细胞内质网上的IP3受体结合,从而导致内质网上的Ca²⁺通道开放使得内质网中的Ca²⁺外流至胞质内,当内质网钙离子浓度明显降低后,Ca²⁺与STIM1结合度降低使得Ca²⁺从STIM1上解离,随后STIM1被激活,激活后的STIM1达到细胞膜下,激活Orai1蛋白,Orai1形成了Orai1钙离子通道,引发钙离子内流,并激活下游通路使免疫细胞活化。细胞内钙离子增加是免疫细胞活化的重要标志之一。近年来,有研究发现,STIM1除了能感受细胞内钙浓度的变化,其还是一种细胞外界物理刺激感受蛋白,可感受细胞内的温度变化,被细胞内的温度所激活,激活后的STIM1可同其他刺激激活过程一样的开启下游钙通道,引起一系列下游基因变化。所以此过程可能是温热活化免疫细胞,达到治疗孢子丝菌病的目的的机制之一。本实验从人体孢子丝菌病标本,细胞层面以及小鼠孢子丝菌病模型层面探讨温热治疗孢子丝菌病的机制,为今后扩大临床应用提供理论指导意义。材料与方法:1、实验对象查找科室病理研究室病理检查结果为孢子丝菌病的患者资料,将保存的皮损病理标本蜡块制成切片,进行免疫组化染色。细胞系选择为小鼠巨噬细胞系Ana-1作为研究对象。原代细胞为提取的小鼠的骨髓源性巨噬细胞及Naive CD4⁺T细胞。小鼠孢子丝菌病模型为6-8周周龄、体重20±0.1g雌性小鼠。2、温热治疗方案温热治疗应用的仪器是我们科室拥有专利的局部温热治疗仪,温热治疗仪治疗原理为使温热探头并不直接接触患者皮损,而是在指定部位给予光照加热,并使用红外线监测温度,使加热部位保持在设定温度。温热治疗的设定温度对于人体通常为44℃,小鼠为42℃。孢子丝菌病患者温热治疗方法:前三次连续治疗三天,每天一次;隔一周后连续治疗两天,每天一次;然后一周一次治疗直到治愈。小鼠孢子丝菌病温热治疗方法:前三次连续治疗三天,每天一次;隔一周后连续治疗两天,每天一次;一周后治疗一次。细胞温热:将细胞种于六孔板后过夜,将水浴锅调至实验设定温度后,将六孔板放入水浴锅中的水面温热处理,温热处理30分钟,温热处理结束后将细胞重新放入培养箱中培养。3、免疫组化检测相关蛋白将组织标本蜡块用冰冻切片机调至4μm厚度后切片,进行免疫组化实验,检测巨噬细胞M1标志物CD86、巨噬细胞M2标志物CD206表达。在20倍物镜下随机选取5个视野,计数视野内CD206阳性与CD86阳性细胞的比值,并将比值取平均值。4、实时荧光定量PCR检测各因子的表达采用实时荧光定量PCR方法检测冰冻孢子丝菌病患者皮肤标本中及细胞实验的细胞中各因子的表达。提取总RNA时使用Qiagen提取试剂盒;RNA反转录合成cDNA时使用PrimeScript RT regagent Kit,方法遵照说明书;将cDNA实时荧光定量PCR扩增SYBR Premis Ex Taq,方法遵照说明书,并采用双标准曲线法行相对定量的结果分析。5、MTS检测温热细胞增殖的影响检测温热对细胞增殖的作用时使用MTS试剂。分别于第0天、1天、2天、3天和4天加入MTS后用酶标仪检测种于96孔板中细胞的增殖情况,酶标仪设定为检测490nm的吸光度值。利用吸光度值计算细胞增殖情况。6、荧光酶标仪检测胞内钙离子含量利用荧光酶标仪,检测温热后细胞内钙离子的变化。将细胞种于96孔黑色酶标板中,用Fluo-4 AM检测细胞内钙离子含量较。7、流式细胞术检测温热对凋亡的影响温热对细胞凋亡的影响的检测依靠流式细胞仪。做法为温热处理的前一天将细胞接种于六孔板中,第二天根据设定的温热,在水浴锅中温热处理后,放入细胞培养箱中重新培养,24小时后使用FITC AnnexinⅤ凋亡试剂盒根据细胞的十字象限分布情况计算温热后细胞凋亡的变化。8、统计学分析资料的统计学分析及绘制统计图使用GraphPad Prim（version 5.0）软件。当实验条件只有一个变量,即为两组数据比较有差异与否时用unpaired t test的统计方法。当实验条件为一个以上变量,即两组以上数据时比较使用方差分析的统计方法。P<0.05时具有统计学差异。结果:1、孢子丝菌病患者皮损中巨噬细胞的极化方向和Th1和Th2的分化情况。荧光定量PCR结果显示:孢子丝菌病患者皮损中,Arginase-1的RNA相对表达量明显高于iNOS的表达量,p<0.05;孢子丝菌病患者皮损IL-2的RNA相对表达量明显低于正常人皮损,p<0.05,孢子丝菌病患者皮损的IL-4的RNA相对表达量高于正常人皮损,p<0.05,患者皮损中IFN-γ和IL-10的表达量与正常人无差异。免疫组化结果显示:M2型巨噬细胞表面标志物CD206相对表达量明显多于M1型巨噬细胞的表面标志物CD86,p<0.05。2、42℃温热可通过激活CRAC钙通道对多种细胞系的凋亡水平产生影响42℃温热可提高多种皮肤科常用细胞系的凋亡水平。且除了三种HPV阳性的宫颈癌细胞系HeLa、Caski和SiHa以外,对于其他几种细胞系（包括HPV阴性宫颈癌细胞系C33A）,温热可通过激活CRAC钙通道增加凋亡水平;即在温热处理前用CRAC钙通道抑制剂处理细胞,则温热对细胞的凋亡影响被明显抑制。而对于三种HPV阳性的宫颈癌细胞系,温热前用CRAC钙通道抑制剂处理细胞,并不能使温热对细胞的促进凋亡能力被抑制。这说明对于实验中所用的几种细胞系来说,温热可通过激活CRAC钙通道来增强除了HPV阳性以外细胞的凋亡水平。而三种HPV阳性的宫颈癌细胞,温热对其增加凋亡水平的作用可能不通过这一通路,或有其他挽救通路。3、42℃温热对巨噬细胞抗原呈递能力及杀灭胞内孢子丝菌能力的影响温热处理可提高巨噬细胞抗原提呈能力,而在温热处理前使用CRAC钙通道抑制剂处理细胞,则温热对巨噬细胞的抗原提呈能力被明显减弱;这说明42℃温热可通过激活CRAC钙通道提高巨噬细胞抗原提呈能力。温热处理后的巨噬细胞,杀灭胞内孢子丝菌的能力明显提高,而温热处理前使用CRAC钙通道抑制剂对温热这一影响没有抑制作用;这说明42℃温热可以提高巨噬细胞杀灭胞内孢子丝菌能力,但并不通过CRAC钙通道。温热处理巨噬细胞,可使巨噬细胞与CD4⁺T细胞的共培养体系,杀灭孢子丝菌的能力提高,而CRAC钙通道抑制剂可明显抑制温热这一作用;这说明42℃温热通过CRAC钙通道提高巨噬细胞与CD4⁺T细胞共培养体系的杀灭胞内孢子丝菌的能力。4、42℃温热治疗可以通过激活CRAC钙通道促进小鼠孢子丝菌病模型的治愈,42℃温热可以通过激活CRAC钙通道增加皮损中IFN-γ的表达水平。给予孢子丝菌病模型小鼠温热治疗,可明显促进小鼠皮损的消退,而温热处理前皮内注射CRAC钙通道抑制剂BTP2的温热处理小鼠,温热促进皮损消退的效应被明显减弱;这说明42℃温热治疗可以通过激活CRAC钙通道促进小鼠孢子丝菌病模型的治愈。温热处理可使孢子丝菌病模型小鼠皮损处IFN-γ的表达水平,而温热处理前皮内注射CRAC钙通道抑制剂BTP2,可使温热这一作用明显减弱;这说明42℃温热可以通过激活CRAC钙通道增加皮损中IFN-γ的表达水平。结论:1、皮肤型孢子丝菌病病变皮肤标本中巨噬细胞主要向抑制炎症反应的M2方向极化,且辅助性T淋巴细胞主要向Th2型分化。2、42℃温热提高巨噬细胞抗原提呈能力及杀灭胞内孢子丝菌能力,且42℃温热通过CRAC钙通道提高巨噬细胞抗原提呈能力。3、温热治疗主要通过激活CRAC钙通道促进小鼠孢子丝菌病模型的治愈。