肿瘤(tumor)是机体在多重致癌因素作用下,特定组织中某种细胞失去正‘常生长调控能力,进而发展为异常性无限增生的病变现象。肿瘤的发生进展与肿瘤细胞自身及其所处的局部环境密切相关。一方面,肿瘤细胞通过自我突变以及蛋白修饰等方法对宿主免疫系统识别的靶点加以隐蔽或丢弃,从而逃避免疫系统的监视；另一方面,肿瘤细胞通过编织复杂的网络,形成特定肿瘤微环境,为其迅速增殖、持续化的新血管生成以及侵袭和远处转移提供适宜的土壤。目前研究广泛认为：肿瘤微环境为肿瘤的发生、进展、远处转移等行为提供外在保障。旨在通过打破该微环境从而达到干预肿瘤生长及进展的治疗策略正愈发受到关注。与肿瘤微环境相似,妊娠早期母胎界面同样维持免疫耐受微环境从而有利于胚胎成功植入母体子宫。胚胎来源的滋养层细胞(trophoblast cells)具有高分裂增殖能力、高侵袭性等恶性肿瘤细胞的显著特征。然而与恶性肿瘤相反,该细胞的上述特征具有高度时空限制性——胚胎一旦成功植入母体子宫,滋养层细胞便停止侵袭、增殖。鉴于此,很多研究试图通过利用滋养层细胞功能及调控机制的研究以期寻找肿瘤治疗的新途径。肿瘤微环境由肿瘤细胞、基质细胞、内皮细胞、纤维母细胞、免疫细胞等细胞组分；以及多种抑制性细胞因子、趋化因子、信号分子、胞外基质等非细胞组分共同构成。其中免疫细胞群体包含：肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、髓源抑制性细胞(MDSC)、肿瘤相关中性粒细胞(TAN)、肿瘤相关Th17细胞、调节性树突状细胞(DCreg)以及调节性T细胞(Treg)等。肿瘤细胞与募集至此的宿主免疫细胞发生交互对话(crosstalk),使得原本具有攻击性的免疫细胞发生诱导再驯化(reeducation),从而有利于肿瘤微环境中免疫耐受的建立。研究证实,作为肿瘤微环境中数目最大的免疫细胞群体,TAM在某些肿瘤中所占比例可高达50%。该细胞具有M2巨噬细胞(Alternatively activated macrophages)特征,能够优势产生包括TGF-β, IL-4, IL-10以及PGE2在内的多种抗炎细胞因子,在肿瘤组织中的浸润数目及其位置与肿瘤的预后呈密切相关。提示：TAM在肿瘤免疫及肿瘤微环境的建立及维持方面具有重要作用。此外,单核系髓源抑制细胞亚群(Mo-MDSC)是新近发现的一类广泛存在于患者肿瘤组织中的免疫抑制细胞。该细胞一方面通过释放VEGF、bFGF以及MMPs促进肿瘤血管形成,另一方面通过高表达ARG-1、COX2、IDO1、IL-4Rα等免疫抑制分子抑制T细胞、NK细胞和巨噬细胞介导的抗肿瘤免疫应答。已证实,作为维持肿瘤免疫耐受微环境主力的TAM与Mo-MDSC均由髓源单核细胞(myelomonocytic cells)分化产生。提示,肿瘤组织中异常增多的TAM与Mo-MDSC可能是由肿瘤微环境募集髓源单核细胞并加以诱导分化产生的结果。然而,肿瘤微环境对其进行诱导分化的具体途径目前仍然知之甚少。肿瘤微环境中存在的多种促免疫抑制作用细胞因子、趋化因子及信号分子,对于募集驯化免疫细胞、活化内皮细胞生成血管、促进肿瘤细胞的侵袭及粘附均发挥重要作用。其中,趋化因子配体2(chemokine(C-Cmotif)ligand2,CCL2),在口腔鳞状细胞癌(OSCC)、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、直肠癌等肿瘤组织中均发现有异常升高。CCL2作为趋化因子配体首先被证实通过与其受体CCR2结合的方式对髓源单核细胞及其分化产生的巨噬细胞等发挥高效募集迁移作用。研究表明,CCL2在肿瘤组织中的表达水平与肿瘤大小、是否发生转移等预后指标密切相关。此外,进一步研究发现,CCL2能够通过抑制产生Th1型促炎性细胞因子来维持口腔免疫耐受微环境；诱导T细胞极化为具有抗炎功能的Th2型细胞；上调并活化髓源单核细胞的信号转导子和转录激活子-3(STAT-3)——该分子的上调及活化被认为是Mo-MDSC扩增及活化的必要信号。提示：肿瘤微环境中存在异常增高的CCL2可能在对髓源单核细胞的募集、诱导、分化过程中发挥重要作用。肿瘤细胞的分裂增殖、侵袭、迁移、以及肿瘤微环境对免疫细胞诱导再驯化过程中细胞结构及功能的重大改变均涉及到细胞骨架的重排。驱动蛋白超家族(Kinesin superfamily, Kif)是一类微管依赖的分子马达蛋白,参与细胞的骨架重排、有丝分裂以及物质的胞内转运等细胞进程。研究证实,该超家族成员之一Kif4A不但是多细胞进程的必须因子,还是肿瘤发生发展的重要触发器。通过对肺癌以及舌鳞状细胞癌研究发现,Kif4A的表达水平与肿瘤预后呈负相关——该分子表达水平越高,患者瘤体越大,治疗后复发及转移的概率越大。值得注意的是,有报道证实,Kif4A参与T细胞的活化过程。提示,该蛋白对诸如T细胞、巨噬细胞等免疫细胞在肿瘤微环境中的诱导分化具有潜在调控作用。结合已有研究,本课题将从肿瘤微环境中存在高水平的CCL2这一现象入手,通过体外共培养实验探讨该趋化因子在髓源单核细胞诱导分化为具有高度免疫抑制功能的Mo-MDSC以及优势表达抗炎细胞因子的M2样巨噬细胞过程中的作用及其相关机制。并对Kif4A是否参与CCL2对髓源单核细胞的该诱导分化过程加以验证,以期进一步补充CCL2在建立及维持免疫耐受微环境过程中作用及机制。第一部分CCL2及Kif4A对巨噬细胞募集及分化的影响目的：建立体外共培养体系,部分模拟肿瘤微环境中肿瘤细胞与巨噬细胞的相互作用,探讨CCL2及Kif4A在此过程中对巨噬细胞募集及分化的影响。方法：1.建立肿瘤细胞与巨噬细胞共培养体系以舌鳞状细胞癌细胞系Cal-27以及人单核细胞系THP-1诱导产生的M0型巨噬细胞为工具,利用0.4|xm Transwell建立间接共培养体系。2.检测共培养体系中Kif4A以及CCL2/CCR2的改变利用Western blotting检测共培养体系中各类细胞Kif4A、CCR2表达水平,ELISA检测上清中CCL2水平变化,RTQ-PCR角定CCL2的细胞来源。3.阻断共培养体系中各类细胞Kif4A的表达、中和共培养体系CCL2利用siRNA技术分别将共培养体系中不同细胞组分Kif4A沉默,同时设scrRNA对照处理组,Western blotting;检测感染效率。利用中和抗体消除共培养体系中CCL2的作用,同时设同型对照抗体处理组。4.检测肿瘤细胞对巨噬细胞募集能力利用8 μm Transwell检测阻断Kif4A或中和CCL2, Cal-27细胞对巨噬细胞募集能力的改变。5.促炎/抗炎细胞因子及免疫抑制分子表达水平比较RTQ-PCR检测不同处理条件下共培养体系中巨噬细胞促炎细胞因子TNF-α、 IL-1β、IL-6、IL-12p40;抗炎细胞因子TGF-β、IL-4、IL-10;免疫抑制分子ARG-1、COX2、IDO1、IL-4Rα、NOS2表达的改变。结果：1.Cal-27诱导THP-1来源巨噬细胞Kif4A及CCR2表达的上调Western Blotting检测发现,共培养体系中THP-1来源巨噬细胞Kif4A以及CCR2的表达较单独培养时显著上调(p<0.01)。Cal-27细胞高表达Kif4A,而共培养体系对其无显著影响。2.阻断Kif4A,能够显著抑制共培养体系上调的CCL2水平ELISA及RTQ-PCR检测证实,共培养能够显著上调Cal-27细胞以及THP-1来源巨噬细胞CCL2表达及分泌水平(p<0.01)；利用siRNA阻断共培养细胞Kif4A,能够显著抑制CCL2的表达(p<0.01)。3.Cal-27对THP-1来源的巨噬细胞的募集能力受Kif4A-CCL2调控迁移实验证实,共培养体系中Ca-127对THP-1来源的巨噬细胞具有较强的募集能力。阻断Cal-27或巨噬细胞的Kif4A,中和共培养体系中的CCL2,该募集能力均受到显著削弱(p<0.01)。4. Kif4A-CCL2介导共培养体系THP-1来源的巨噬细胞功能改变RTQ-PCR结果显示阻断共培养体系Kif4A表达或中和CCL2能显著抑制巨噬细胞抗炎型细胞因子表达；促进促炎型细胞因子表达。此外,共培养能后显著上调巨噬细胞免疫抑制分子ARG-1、COX2、IDO1、IL-4Rα表达,阻断共培养体系Kif4A表达或中和CCL2同样能后抑制共培养体系对巨噬细胞免疫抑制分子表达的促进作用。小结：肿瘤细胞与巨噬细胞交互对话导致肿瘤微环境中CCL2显著增高。CCL2在肿瘤细胞对巨噬细胞的募集及M2诱导分化方面发挥重要作用,而Kif4A对该过程具有调控功能。该发现揭示了肿瘤微环境中高水平的CCL2是大量巨噬细胞募集至此并分化为优势表达抗炎细胞因子的M2型巨噬细胞的潜在诱因。而Kif4A对CCL2的正向调控作用提示其可能成为新的肿瘤治疗靶点。本部分创新点：本研究首次发现肿瘤细胞可以诱导巨噬细胞Kif4A的表达上调：上调的Kif4A能够诱导CCL2以及CCR2表达显著增高,进而有利于肿瘤细胞对其的募集迁移作用；Kif4A-CCL2-CCR2途径能够诱导巨噬细胞分化为优势表达抗炎细胞因子的M2样巨噬细胞,并使其具有部分Mo-MDSC特征。第二部分CCL2调控髓源单核细胞分化为MDSCsi机制研究目的：探讨CCL2在CD14+髓源单核细胞分化为Mo-MDSCs过程中的调节作用,进一步揭示CCL2在建立免疫耐受微环境中的作用机制。方法：1.检测妊娠早期人外周中Mo-MDSCs比例流式细胞术分别检测适龄未孕、早孕女性外周Mo-MDSCs (CD14+ HLA-DR-/low)所占CD14+髓源单核细胞比例。2.分选获取髓源单核细胞以及CD4+T细胞利用密度低度离心法分离获取健康适龄女性志愿者外周血单个核细胞(PBMC),采用CD14磁珠阳性分选获取CD14+髓源单核细胞,采用CD4磁珠阳性分选获取CD4+T细胞,流式细胞术验证细胞纯度。3.建立体外共培养体系将胚胎来源的滋养层细胞系HTR8/SVneo与分选获得的髓源单核细胞按1：1比例进行直接共培养40小时。4.检测共培养体系中细胞因子表达的改变ELISA检测共培养体系上清中CCL2, TGF-β,IL-4,IL-6,IL-8以及IL-10水平。同时设置两种细胞单独培养对照组。5.分选共培养体系不同群体的髓源单核细胞利用流式分选技术将共培养体系中CD14+髓源单核细胞分离出来,然后将其进一步分离为Mo-MDSCs (CD14+ HLA-DR-/low)及非Mo-MDSCs部分(CD14+HLA-DR+)6.T细胞抑制实验将共培养体系经流式分选获得的CD14+髓源单核细胞、Mo-MDSCs、非Mo-MDSCs单核细胞分别按1：1比例与CFSE标记的T细胞进行共培养3,5,7天。同时设置阳性对照组以及阴性对照组。7.免疫抑制分子的检测RTQ-PCR检测流式分选获取的共培养体系CD14+髓源单核细胞、Mo-MDSCs、非Mo-MDSCs单核细胞ARG-1、COX2、IDO1、IL-4Rα以及NOS2表达的改变。8.CCL2中和实验抗体中和共培养体系中的CCL2,流式细胞术检测Mo-MDSCs比例改变情况、该细胞抑制T细胞增殖能力的变化；RTQ-PCR检测CD14+髓源单核细胞、Mo-MDSCs免疫抑制分子表达情况的改变。9. STAT3在共培养体系CD14+髓源单核细胞、Mo-MDSCs表达水平的检测Western blotting检测共培养体系中CD14+髓源单核细胞、Mo-MDSCs表达STAT3以及pSTAT3的水平。结果：1.妊娠早期Mo-MDSCs水平上升,滋养层细胞对其有显著诱导作用妊娠早期女性外周血中Mo-MDSCs所占CD14+髓源单核细胞比例较之适龄未孕女性有显著提高。共培养实验证实,胚胎来源的滋养层细胞能够显著诱导CD14+髓源单核细胞分化为Mo-MDSCs(p<0.01)。2.滋养层细胞诱导的Mo-MDSCs能够显著抑制T细胞增殖共培养体系的Mo-MDSCs (CD14+HLA-DR-/low)较之单独培养的CD14+髓源单核细胞以及共培养体系非Mo-MDSCs部分(CD14+ HLA-DR+)能够显著抑制T细胞增殖(p<0.01)。3.滋养层细胞能够诱导CD14+髓源单核细胞CCL2表达及分泌的显著上升ELISA及RTQ-PCR证明,滋养层细胞能够显著诱导CD14+髓源单核细胞CCL2的表达及分泌(p<0.01)；而对IL-4,IL-6,IL-8以及IL-10无显著作用。4.CCL2对Mo-MDSCs诱导分化具有重要作用中和共培养体系中的CCL2能够显著下调Mo-MDSCs所占比例(p<0.01),并使共培养体系CD14+髓源单核细胞对T细胞的抑制能力严重削弱。此外,该分子能够显著下调CD14+髓源单核细胞及Mo-MDSCs的免疫抑制分子Arg-1的表达(p<0.01)。5.CCL2对Mo-MDSCs的诱导作用与STAT3的活性密切相关Western blotting检测表明,共培养显著上调CD14+髓源单核细胞(p)STAT-3的表达,而中和CCL2能够显著降低其STAT-3水平。小结：与肿瘤细胞具有高度相似性的妊娠早期滋养层细胞能够诱导CD14+髓源单核细胞分泌大量的CCL2；而高水平的CCL2能通过活化STAT-3信号而促进CD14+髓源单核细胞分化为Mo-MDSCs。该研究发现进一步证实了CCL2在髓源单核细胞诱导分化方面发挥的重要作用,这也为基于该分子的抗肿瘤免疫治疗提供新的思路。本部分创新点：本研究通过体外共培养实验首次证实滋养层细胞能够诱导CD14+髓源单核细胞分化为CD14+HLA-DR/low Mo-MDSC;通过中和抗体方法证实,滋养层细胞对Mo-MDSC的诱导作用有赖于CCL2介导活化的STAT-3信号通路。通过本研究我们证实,肿瘤细胞与巨噬细胞交互对话是导致肿瘤微环境中CCL2显著增高的重要原因。该趋化因子在肿瘤细胞对巨噬细胞的募集及M2诱导分化方面具有重要调控作用,而分子马达蛋白Kif4A参与并介导此过程。此外,CCL2能够通过活化STAT-3信号通路诱导具有高度可塑性的CD14+髓源单核细胞分化为高效免疫抑制细胞MDSC,并上调该细胞群体的免疫抑制分子表达。上述发现首次将肿瘤及妊娠微环境中高水平的CCL2与显著增多的MDSC密切联系起来；揭示肿瘤微环境中高水平的CCL2是大量巨噬细胞募集至此并分化为优势表达抗炎细胞因子的M2型巨噬细胞以及MDSC的潜在诱因；而Kif4A对CCL2的正向调控作用提示其可能成为新的肿瘤治疗靶点。这为旨在打破免疫耐受微环境的新肿瘤治疗策略的制定以及肿瘤患者预后分析提供了可行的依据。