转基因技术日益成为作物性状改良的重要手段，并为人类带来巨大收益，但由于目前大多使用抗生素或除草剂类基因作为筛选标记基因，对环境和人类健康存在或潜藏着无法估计的不良影响和损害，从而限制了转基因作物在商业生产中的推广利用。目前解决这一问题最有效的方法就是利用无争议的生物安全标记基因。有鉴于此，本研究利用柑橘为试材，对安全的转基因筛选体系-磷酸甘露糖异构酶(PMI)/甘露糖筛选体系进行了初步的研究。 本研究以无籽沙糖橘田间成年态1cm左右的半木质化茎段为材料，比较系统地摸索了影响离体再生的多种因素，初步建立了无籽沙糖橘成年态茎段的再生体系；以甜橙实生黄化苗茎段为材料，确立了甘露糖对上胚轴筛选压；从大肠杆菌中克隆了PMI基因，构建了含PMI基因的pCAMBIA1301-PMI植物表达载体。取得的主要结果如下： 1、无籽沙糖橘田间成年态茎段再生体系的建立 以无籽沙糖橘田间成年态1cm左右的茎段为外植体，开展了外植体的消毒方法研究；另外，还研究了外植体在培养基中的放置方式、光照强度等因素对诱导不定芽的影响。结果表明：田间茎段的最佳消毒方法是：取田间成年态半木质化枝条，用自来水冲洗，然后用0.1％升汞消毒10min，再用无菌蒸馏水冲洗4～5次；外植体在培养基中的放置方式以平放效果最好，同时发现外植体带腋芽茎段的的生长情况明显高于不带腋芽的茎段；外植体接到培养基上以后开始先在暗培养条件下培养两周，再转入到光照条件下进行培养，对诱芽的效果最好。 应用正交设计试验法探讨了基本培养基、6-BA、NAA、CH因素对诱导无籽沙糖橘田间成年态茎段高频率定芽的影响，结果显示：在此四种因素中，影响出芽数最重要的因素是6-BA，其次是基本培养基、CH和NAA。基本培养基最好的是MT培养基。同时，发现无籽沙糖橘茎段带腋芽的茎段才有能诱导出芽，不带腋芽的没有芽出现。最佳的培养基配方是： MT+CH 500mg/L+6-BA1.0mg/L-NAA1.0mg/L+Suc 30g/L+Agar 8g/L。 2、甜橙实生黄化苗上胚轴甘露糖筛选压的确立 以甜橙实生黄化苗上胚轴为外植体，研究了甘露糖对上胚轴诱芽的影响，发现甜橙在转化实验中甘露糖的筛选浓度20g/L左右为好。 3、含PMI筛选基因的植物表达载体的构建 根据GenBank(accession M15380)中大肠杆菌(Escheriachia coli)的PMI基因的序列设计引物，通过PCR的方法得到约1200bp片段，把克隆片段插入pMD-18克隆载体，经蓝白斑筛选和酶切鉴定后，得到了新的重组质粒pMD18-PMI，测序和序列分析表明与已发表PMI基因序列同源性达到100％。将该基因替换植物表达载体pCAMBIA1301中的潮霉素磷酸转移酶(HPT)筛选标记基因，构建了以PMI为筛选标记基因的植物表达载体pCAMBIA1301-PMI。