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林蛙及其产品不仅是宝贵的中药材,也是味美佳肴和良好的滋补品。林蛙油为雌性林蛙输卵管的干制品,是传统药食两用的保健品。我国是林蛙油的优势产区,尤其是东北地区拥有着得天独厚的地理优势和资源优势,出产的林蛙油品质优良,目前已有越来越多的消费者食用。目前,市场上的林蛙油多以普通干制品形式存在,其中的蛋白质含量丰富,粗蛋白含量高达50%以上,传统的食用方法十分不利于消化、吸收,也不利于加工和应用。林蛙油蛋白经过酶水解后,可产生不同分子量并具有不同生理活性的短肽,比蛋白质更容易被机体消化和吸收,使林蛙油的营养成分得到充分利用的同时具有免疫调节作用。本论文以产自吉林省白山市抚松县的林蛙油为实验对象,检测其主要化学成分,确定酶解制备林蛙油活性肽的工艺条件,并对林蛙油活性肽的小鼠免疫增强功能等做了较为系统的研究。具体的研究内容及取得的结果如下:1、林蛙油成分的分析及林蛙油活性肽(bioactive peptides from the oviductusranae,BPOR)的制备由于林蛙油中的营养成分因产地、气候、品种、取油手法、干燥形式、保存时间及方法的不同而存在差异,本论文首先测定实验原料林蛙油的主要成分含量,结果为:蛋白质含量为50.05%,灰分为4.46%,粗脂肪4.19%,水分含量为10.12%,可溶性蛋白占总干重的11.03%。经单因素和正交试验确定了以木瓜蛋白酶和中性蛋白酶复合酶解林蛙油的最佳工艺条件为:加酶量5000(U/g),水解时间5h,温度60℃,在此条件下林蛙油的水解度达到28.45%。冻干后为黄褐色精细粉末,有苦味,易吸潮,在p H1-12范围内具有良好的溶解性。检测结果表明其中由17种氨基酸组成,含量丰富,种类平衡。分离林蛙油活性肽为BPOR1(1~5k D)及BPOR2(5~8k D)两种组分。通过高效液相色谱和质谱法分析BPOR1(BPOR1)中分子量的分布情况,结果表明,BPOR1中氨基酸及短肽含量丰富。2、林蛙油活性肽对小鼠免疫调节功能的影响为明确不同分子量区间林蛙油活性肽对小鼠免疫调节功能的影响,本论文以不同剂量林蛙油活性肽BPOR1及BPOR2给正常小鼠灌胃30d,观察给药期间各组小鼠的精神状态与体重差异变化等,并计算胸腺指数及脾脏指数。同时以BPOR1和BPOR2作用于小鼠脾脏中的淋巴细胞,探讨其对T淋巴细胞增殖的影响,以及从先天性免疫细胞如NK细胞、获得性细胞免疫和体液免疫等角度研究其免疫功效。结果表明,林蛙油活性肽BPOR1和BPOR2对小鼠T、B淋巴细胞亚群、血清中细胞因子IL-4、IFN-γ和肠道SIg A的浓度及均有一定的影响。两种林蛙油活性肽对小鼠脾脏指数和胸腺指数均有影响,且都具有刺激体外淋巴细胞增殖的作用。BPOR1能更明显增加正常小鼠的脾脏指数及胸腺指数,且40~100μg/m L浓度的BPOR1可明显促进小鼠T淋巴细胞增殖。BPOR1可更为显著的增加CD49b+NK、CD3+T、CD4+T、CD19+B淋巴细胞数量,增加小鼠血清中的IFN-γ含量,而使IL-4的含量降低,增加小鼠肠道内SIg A浓度。通过BPOR1和BPOR2对小鼠的细胞免疫、体液免疫、黏膜免疫等检测指标的影响进行综合分析比较,可知BPOR1可以更明显地增强机体的免疫功能。3、林蛙油活性肽对免疫抑制小鼠免疫功能的影响肿瘤常规疗法中的放疗和化疗使机体免疫功能受到抑制,为进一步明确林蛙油活性肽BPOR1对免疫抑制小鼠免疫功能的作用效果,本论文通过腹腔注射环磷酰胺(CTX)和X-射线辐照两种方法制备免疫抑制小鼠模型,以低剂量(50mg/kg/d)、中剂量(300mg/kg/d)、高剂量(500mg/kg/d)的BPOR1经口灌胃免疫抑制小鼠14d后,从小鼠的体重、非特异性免疫如免疫器官指数、特异性的细胞免疫、体液免疫、黏膜免疫以及相应免疫细胞因子的含量等指标,分析BPOR1对免疫抑制小鼠的免疫功能影响。结果如下:3.1 BPOR1可促进CTX免疫抑制小鼠免疫器官的修复,显著(p<0.05)促进体重恢复,明显(p<0.05)提高脾脏指数及胸腺指数。在CTX免疫抑制组试验中,中剂量给药可显著(p<0.05)增强小鼠脾脏中各淋巴细胞亚群,其中CD3+T含量达到29.03%,CD4+T为18.04%,CD8+T的比例为7.23%,比模型组分别提高了41.96%、68.76%和57.52%,而CD49b+NK较模型组(1.27%)提高了85.04%,以及CD19+B较模型组(10.67%)提高了103.12%,同时中剂量的BPOR1可显著(p<0.05)促进CTX免疫抑制小鼠血清中细胞因子IFN-γ的分泌,比模型组(6.92pg/mg)提高了39.88%;高剂量组的BPOR1较模型组(10.68 pg/mg)显著(p<0.05)降低了血清中IL-4的含量达到5.09 pg/mg;中剂量组可显著(p<0.05)提高小鼠肠道内SIg A的浓度,比模型组(3.44μg/mg)提高了54.65%;3.2 BPOR1可促进X-射线辐射导致免疫抑制小鼠免疫器官的修复,显著(p<0.05)促进体重恢复,明显(p<0.05)提高脾脏指数及胸腺指数。在X-射线组小鼠中,与模型组对比,中剂量给药组可显著(p<0.05)增强小鼠脾脏中各淋巴细胞亚群,其中CD3+T含量达到30.56%,CD4+T为18.17%,CD8+T的比例为7.00%,比模型组分别提高了47.78%、65.78%和54.87%,而CD49b+NK较模型组(1.25%)显著(p<0.05)提高了85.6%,以及CD19+B较模型组(9.97%)显著(p<0.05)提高了120.86%,同时中剂量的BPOR1可显著(p<0.05)促进X-射线免疫抑制小鼠血清中细胞因子IFN-γ的分泌,比模型组(6.90pg/mg)提高了34.64%;血清中IL-4的含量较模型组(10.60 pg/mg)显著(p<0.05)降低了24.62%;中剂量组可显著(p<0.05)提高小鼠肠道内SIg A的浓度,比模型组(3.45μg/mg)提高了52.17%。因此BPOR1可以促进CTX及X-射线辐射导致免疫抑制小鼠的免疫功能的恢复,具有免疫增强作用。