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实验背景:黄酮类化合物广泛存在于水果、坚果、蔬菜和草药中,具有多种药理活性。目前,已有多种黄酮类药物在临床上得以应用,但是没有一种药物被指定可以全身用药。其中一个重要的原因是该类化合物容易发生II相代谢（如葡萄糖醛酸化反应、磺化反应）,导致其口服生物利用度较低。甘草素是中药甘草的主要活性成份之一,属于黄酮类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗糖尿病、抗癌和护肝等多种药理作用。然而,较低的生物利用度一定程度上限制了其临床使用。此外,有研究报道,在大鼠、小鼠、家兔和犬的体内可检测到甘草素的II相代谢产物（葡萄糖醛酸化代谢物和SULT代谢物）。因此我们推测,II相代谢的发生可能是导致甘草素生物利用度低的一个重要因素。目前,甘草素的葡萄糖醛酸化代谢已有研究报道,而其磺酸化代谢情况尚未明确。实验目的:本论文研究的目的是考察甘草素磺酸化代谢的动力学特征,评价外排转运体（如BCRP和MRPs）在甘草素磺酸化代谢物外排中的作用。明确甘草素磺酸化特性及其影响因素,将为指导其临床合理用药提供科学依据。实验方法:首先采用酶孵育法,测定甘草素在不同的人源重组SULTs酶的代谢动力学模型和动力学参数。然后,采用转染技术构建SULT1A3高表达的HEK293细胞株（缩写为HEK-SULT1A3细胞）。为了确认所构建的HEK-SULT1A3细胞株是否具有SULT1A3酶的功能,分别测定甘草素在HEK-SULT1A细胞裂解液和人源重组SULT1A3酶中的代谢动力学,并对其进行相关性分析。此外,使用化学抑制法（即BCRP的抑制剂Ko143和MRPs的抑制剂MK-571）及生物抑制法（shRNA介导的基因沉默）,检测外排转运体在甘草素磺酸化代谢物外排中的作用。最后通过用瞬时转染法,在HEK-SULT1A3细胞株中建立单个外排转运体低表达的细胞模型,并检测外排转运体在甘草素磺酸化代谢物外排中的作用,考察外排转运蛋白对甘草素磺酸化代谢的影响。实验结果:1、甘草素在与人源重组SULT1A1、SULT1A2、SULT1A3、SULT1B1、SULT1C2、SULT1C4、SULT1E1、SULT2A1酶进行孵育反应时,各亚型酶均能催化甘草素生成甘草素7位羟基磺酸化取代产物（7-O-Sulfonate）,酶动力学均符合米氏方程模型。并且根据内在清除率CLint值,不同亚型酶催化甘草素-7-OH磺酸化代谢的活性依次是SULT1C4>1A3>1E1>1A1>1A2>1B1>1C2>2A1。与SULT1C4相比,SULT1A3代谢甘草素的米氏常数（Km）值较小,说明SULT1A3与甘草素具有更好的亲和性,在甘草素磺酸化代谢中起重要作用。2、HEK-SULT1A3细胞裂解液和人源重组SULT1A3酶均代谢甘草素产生一个磺酸化代谢物,即甘草素-7-O-Sulfonate（Liq-7-O-S）。在rSULT1A3酶中,甘草素的代谢动力学参数Vmax为18.50 nmol/min/mg,Km为6.58μM;细胞裂解液的Vmax为0.83nmol/min/mg,Km为7.12μM,两组的米氏常数没有差异（p>0.05）。HEK-SULT1A3细胞裂解液与SULT1A3重组酶催化甘草素（7-OH）的代谢动力学特征具有显著相关性（r=0.9653,p<0.001）,说明本论文中构建的HEK-SULT1A3细胞具有人源SULT1A3酶的功能。3、当使用BCRP抑制剂Ko143时,甘草素磺酸化代谢物的外排速率和清除率均显著下降,当抑制剂浓度在20μM时,其外排速率和清除率分别显著降低42.5%（p<0.001）,60.0%（p<0.001）。当使用广谱的MRPs抑制剂MK-571,甘草素磺酸化代谢物的外排速率和清除率同样显著下降,在20μM时,对甘草素磺酸化代谢物的外排速率和清除率分别显著降低97.4%（p<0.05）,99.3%（p<0.001）。4、采用瞬时转染的方法,敲低HEK-SULT1A3细胞中的转运蛋白BCRP后,发现其外排速率和清除率分别降低15.9%-16.9%和26.5%-29.5%,采用相同方法,敲低MRP4蛋白表达后,甘草素磺酸化代谢物的外排速率和清除率分别降低了20.2%-32.5%和44.8%-47.1%。此外,敲低上述两种外排转运蛋白表达后,导致甘草素在HEK-SULT1A3细胞中的总代谢程度(fmet)分别降低了20.6%和22.2%,说明外排转运体具有调控甘草素胞内磺酸化代谢的作用。实验结论:BCRP和MRP4在甘草素化代谢物的外排起重要作用,并且能调控甘草素磺酸化代谢。