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手足口病（Hand,foot and mouth disease,HFMD）是一种由肠道病毒（Enterovirus,EV）感染导致的儿童（小于五岁）常患病,偶发成人,传染性极强。其中,柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16,CVA16）和肠道病毒71型（Enterovirus A71,EV71）是导致HFMD最常见的病原体。HFMD是全球传染性疾病,主要在亚太地区暴发流行,欧洲和北美等地近年也出现大规模流行。自2008年爆发HFMD以来,我国已累计报告病例超过2200万,每年有200万左右新增。HFMD是我国发病率最高、死亡人数最多的丙类传染病之一,对全球尤其是我国造成巨大公共卫生压力。疫苗是防控HFMD最为经济有效的手段。目前EV71灭活疫苗上市,但其不能交叉保护CVA16导致的HFMD及相关疾病。因此,CVA16疫苗是现在防控HFMD的研究重点。但据最新研究显示EV71疫苗的成功经验并不完全适用于CVA16。优势中和表位信息未知、保护性免疫原不明确和免疫保护机制不明等问题严重制约了 CVA16疫苗的研发。本研究综合运用生物化学、免疫学、结构生物学和细胞生物学等技术手段全面揭示CVA16不同病毒颗粒形式结构差异,阐明不同类型具有治疗效果的中和抗体与病毒互作分子机制,验证了 CVA16成熟病毒颗粒可以作为疫苗的有效候选免疫原,并建立一套针对候选免疫原特异性检测方法。首先,本研究通过优化CVA16病毒的收获和纯化条件,获得了高浓度和纯度的CVA16实心和空心病毒颗粒。利用冷冻电镜（cryo-electronmicroscopy,cryo-EM）单颗粒三维重构分析发现,CVA16和其他肠道病毒类似,具有三种病毒颗粒形式。我们分别获得了分辨率为3.56 A的成熟病毒颗粒（CVA16mature virion,CVA16-M）、3.33（?） 的脱衣壳中间态颗粒（CVA16A-particle,CVA16-A）和 3.43（?）的空心颗粒（CVA16 empty particle,CVA16-E）结构。结构分析显示CVA16-M和CVA16-A内部含有基因组,且基因组结构具有明显差异,而CVA16-E不含基因组。此外,CVA16-A和CVA16-E衣壳结构高度相似,较CVA16-M体积增大约4%,二倍轴孔径张开,五倍轴隆起,VP1的N端部分残基、VP4蛋白和口袋因子丢失。进一步通过对CVA16-M和CVA16-A结构对比发现VP2的GH loop和VP3 GH loop具有显著差异,猜测该部分结构域可能是CVA16病毒入侵宿主的关键感应器,通过该些结构域与细胞受体结合从而介导病毒入胞,并实现成熟病毒颗粒向A颗粒的转变。以上结果证明CVA16三种病毒颗粒在结构上具有明显差异,提示在研制CVA16疫苗中需要充分考虑不同颗粒形式免疫原的保护效果差异。其次,本研究筛选并获得了三株代表性的CVA16中和单抗18A7、14B10和NA9D7。它们在功能活性上展现出差异。其中18A7可以广泛结合三种CVA16病毒颗粒形式,而14B10和NA9D7只特异结合成熟病毒颗粒。且14B10和NA9D7具有广谱中和效果,在动物实验中展现出预防和治疗潜能。三株中和单抗的结合都可以提高病毒颗粒的热稳定性。以上信息提示这些中和抗体识别表位和中和机制可能具有差异。进一步地,本研究利用cryo-EM技术首次解析了三株抗体的Fab片段和CVA16不同病毒颗粒的免疫复合物高分辨率结构。其中18A7可以结合三种CVA16病毒颗粒形式,分辨率分别为2.65 A（CVA16-M:18A7）、3.07 （?）（CVA16-A:18A7）和 3.13 （?）（CVA16-E:18A7）。有趣的是,每个病毒的五倍轴区域只结合一个18A7,造成Fab和衣壳五倍轴对称失配,进而导致18A7 Fab的密度在重构时错误平均。本研究通过提取局部区域密度,成功克服该种对称失配的抗原抗体结合方式,首次获得了 3.67 A的高分辨率Fab与病毒互作的分子细节。结构分析发现18A7识别表位主要在VP1的DE和HI loops。该区域与已报道受体选择素糖蛋白配体（P-selectin glycoprotein ligand 1,PSGL-1）和硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate,HS）重叠,提示18A7可能可以通过阻断病毒吸附实现中和。病毒逃逸突变实验揭示位点V147为抗体18A7中和的关键位点。与18A7不同,14B10和NA9D7则只结合CVA16的成熟病毒颗粒,表位分别是围绕衣壳的三倍轴和二倍轴区域。高分辨率的CVA16-M:14B10（3.30（?））免疫复合物结构显示14B10主要结合在VP2的BC和HIloop,其中VP2的D74、S230和E231参与大量相互作用。NA9D7识别表位面积广泛,横跨VP1、VP2和VP3蛋白,结合高分辨率结构（3.23 A）和病毒逃逸位点分析,VP1的L220是抗体NA9D7识别的关键位点。14B10和NA9D7识别表位与CVA16病毒的脱衣壳受体—清道夫受体（Scavenger receptor class B member 2,SCARB2）高度重叠。本研究进一步解析获得了 CVA16实心病毒颗粒与抗体14B10和NA9D7结合的三元或与三株抗体共结合的四元高分辨率复合物结构（3.52 A和3.78 A）,证实三个Fab识别表位非重叠,可同时结合至CVA16病毒颗粒。其中高分辨率的四元病毒颗粒免疫复合物结构为首次报道。基于以上三种不同结合方式的高效中和抗体识别表位的分子信息,本研究发现CVA16成熟病毒颗粒保有类似如NA9D7和14B10识别的特异性表位,奠定其可以作为CVA16疫苗有效保护免疫原的分子基础。最后本研究从动物水平验证了包含有大量成熟病毒颗粒的实心颗粒免疫原性显著优于空心颗粒。同时通过比对GenBank上157株CVA16毒株来分析三株抗体识别表位的保守性,发现对三种病毒颗粒都能广泛结合的18A7表位保守性仅为10%。而特异结合CVA16成熟病毒颗粒的14B10和NA9D7保守性分别达99%和97%。另外在人血清阻断抗体的免疫优势性实验中发现NA9D7识别表位具有免疫优势。以上结果表明,在CVA16疫苗开发中,应优先考虑将具有高度保守和特异免疫优势中和表位的CVA16成熟病毒颗粒作为主要候选免疫原。基于此,考虑到在CVA16疫苗工艺开发中成熟病毒颗粒所占比例,会直接影响疫苗效力。同时结合抗体对不同颗粒的反应活性差异,本研究利用抗体18A7和NA9D7建立了基于双抗体夹心的酶联免疫吸附（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA）检测方法,实现对候选疫苗免疫原的质控和长期稳定性考察。综上所述,本研究通过解析获得的11个高分辨率CVA16不同病毒颗粒形式及其与不同抗体Fab片段的cryo-EM结构,首次从分子水平详细揭示了 CVA16三种不同颗粒形式的结构差异,及三种活性各异具有治疗潜能的中和抗体的精确分子机制,阐明了 CVA16成熟病毒颗粒作为疫苗保护性免疫原的结构基础,建立了特异性检测疫苗候选免疫原方法。这些发现为CVA16疫苗的研制和抗病毒药物研发提供了重要理论基础,丰富了肠道病毒衣壳转变、感染入胞和抗体中和机制等基础病毒学理论,其中基于关键中和表位信息指导免疫原筛选的方法也为其他相关病毒的疫苗研发提供重要参考。