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目的:结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,既往有研究发现蛋白激酶相关激酶5(ARK5)可促进多种癌症的转移,并能增强癌症的侵袭性。而最近的证据支持上皮-间质转化(EMT)是肿瘤细胞转移的必经之路。在此次研究中,我们将进行探讨ARK5是否通过调节EMT途径来影响结直肠癌的转移和侵袭。方法:1.临床随机选取134名只接受根治性手术治疗未接受术前放化疗的结直肠癌患者(2013年1月至2014年1月),获取134例患者的结直肠肿瘤组织和癌旁正常组织。通过免疫组织化学检测ARK5和上皮间质转化(EMT)相关标记物并评分。将评分与患者的临床分期、OS等相关数据进行统计学分析。2.设计针对ARK5基因与TWIST基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)序列及阴性对照(negative control,NC)序列,并完成对LV-ARK5-RNAi重组慢病毒载体、LV-TWIST-RNAi重组慢病毒载体和阴性重组慢病毒载体的构建。3.用携带荧光(GFP)的阴性重组慢病毒载体分别感染SW480及HT29细胞,通过荧光倒置显微镜观察并挑选最有效的感染条件。4.培养SW480,HT29两株人结肠癌细胞,以备之后行进一步实验。5.以SW480为例,分为六组:I组为SW480;II组为用SW480+ARK5shRNA病毒感染组;III组为SW480+TWISTshRNA感染组;IV组为SW480+TGF-β1增强组;V组为SW480+TGF-β1+ARK5shRNA感染组;VI组为用SW480+NC阴性病毒感染组。HT29细胞分为同样6组。6.用Western Blot技术检验两株12组细胞中ARK5、E-cadherin、Vimentin及内参β-actin。7.用划痕实验反应两株12组细胞的迁移能力。8.用Trans-well小室模型反应两株12组细胞的侵袭能力。结果:1.临床统计:结直肠癌组织中ARK5和Vimentin的表达水平明显高于邻近正常肠道粘膜组织中的表达水平(分别为p=0.002和p=0.0144)。相反,Ecadherin在结直肠癌组织中表现出较低的表达水平(p<0.001)。结直肠癌组织中ARK5的表达水平与Vimentin的表达呈正相关(p=0.0144),而与E-cadherin的表达却呈负相关(p<0.001)。对134例结直肠癌患者的临床病理学相关分析结果显示,ARK5,E-cadherin和Vimentin的表达水平分别与T分期,pTNM分期和淋巴结转移存在相关性(p<0.05)。淋巴结转移的患者ARK5的免疫组化评分明显高于无转移的患者(p<0.001)。结直肠癌患者中出现ARK5阳性、Vimentin阳性但E-cadherin阴性的情况,分别与较短的总生存期有相关性(分别为p<0.05)。2.慢病毒感染预实验结果:LV-ARK5-RNAi重组慢病毒转染SW480细胞的最佳复感染指数MOI为20,感染体系为内含10%胎牛血清(FBS)的1640低糖培养基+HiTransG A(40ul),感染时间为24h;LV-ARK5-RNAi重组慢病毒转染HT29细胞的最佳复感染指数MOI为20,感染体系为含10%FBS的DMEM低糖培养基+HiTransG P(40ul),感染时间为24h;LV-TWIST-RNAi重组慢病毒转染SW480细胞的最佳复感染指数MOI为60,感染体系为含10%FBS的1640低糖培养基+HiTransG P(40ul),感染时间为24h;LV-TWIST-RNAi重组慢病毒转染HT29细胞的最佳复感染指数MOI为60,感染体系为含10%FBS的DMEM低糖培养基+HiTransG A(40ul),感染时间为24h。3.Western Blot实验结果:在SW480及HT29两株细胞中,均出现当ARK5被慢病毒阻止并下调后E-cadherin会上调,Vimentin会下调。同样两株细胞中,EMT途径被TWIST慢病毒阻止后,E-cadherin上调,Vimentin下调;并且ARK5蛋白表达并未出现改变。最终在用TGF-β1增强EMT途径后,再用ARK5慢病毒感染并阻止表达后,出现ARK5蛋白下调,E-cadherin上调,Vimentin下调的情况。经统计学差异分析可知差异具有统计学意义(P<0.05)。4.划痕实验结果:在SW480及HT29两株,12组细胞中。经ARK5慢病毒阻断后划痕愈合速度明显低于亲本细胞组及阴性病毒对照组。同样划痕愈合速度降低的有经TWIST慢病毒阻断EMT途径的细胞组,以及经TGF-β1增强EMT途径后,再次用ARK5慢病毒阻断ARK5表达的细胞组。而经TGF-β1增强EMT途径后,划痕的愈合速度大幅提升,明显快于亲本细胞及阴性病毒对照组。划痕面积分析结果差异具有统计学意义(P<0.05)。5.细胞侵袭实验结果:在SW480及HT29两株,12组细胞中。经ARK5慢病毒阻断后被固定在小室中的细胞数目明显小于亲本细胞组及阴性病毒对照组。经TWIST慢病毒阻断EMT途径的细胞组,以及经TGF-β1增强EMT途径后,再次用ARK5慢病毒阻断ARK5表达的细胞组,均可见被固定于上小室中的细胞数目小于亲本细胞及阴性病毒对照组。而经TGF-β1增强EMT途径后,上小室固定细胞的数目显著多于亲本细胞及阴性病毒对照组。上小室固定细胞计数差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:ARK5的表达与肿瘤临床分期,淋巴结转移、患者术后生存时间有着密切的联系。ARK5在结直肠癌中对肿瘤细胞的侵袭及转移能力可通过上皮-间质转化(EMT)进行调控。在单纯阻断ARK5以及用TGF-β1增强EMT途径后再次阻断ARK5的细胞实验中,可见ARK5被阻断后,ARK5下调、E-cadherin上调、Vimentin下调;划痕区域愈合减慢,侵袭能力下降。而在单纯使用TWIST慢病毒阻断EMT途径后,同样出现E-cadherin上调、Vimentin下调情况;划痕区域愈合减慢,侵袭能力下降,但是ARK5蛋白的表达却不受相关影响。由此可见,ARK5可能在上游对EMT途径进行调控。