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细胞程序性死亡(PCD)在动植物生长发育过程中普遍存在,具有重要意义。目前,调节细胞程序性死亡的途径主要有三种:死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径。而对内质网途径的具体机制尚不清楚。本实验室在前期研究中发现水稻PRKCSH是PCD相关基因。PRKCSH即蛋白激酶C底物80K-H,该序列编码葡糖苷酶Ⅱ的β亚基,与其催化作用葡糖苷酶Ⅱ的α-亚基相互作用,葡糖苷酶Ⅱ催化去掉N-端α-1,3-连接的葡萄糖。本研究以水稻为材料,具体分析PRKCSH的亚细胞定位及其与内质网介导的PCD之间的关系。首先利用生物信息学方法对PRRKCSHH基因序列和蛋白结构进行了分析:PRKCSH基因大小为1845bp,编码614个氨基酸;主要包含蛋白结构LDLa(低密度脂蛋白受体域A类)、PRKCSH(蛋白激酶C底物)以及N-端的信号肽。根据亚细胞定位预测分析,结合蛋白C-端HDEL序列推测该蛋白很可能定位在内质网上。采用PEG转化法将带有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的PRKCSH转入水稻原生质体中,观察绿色荧光与内质网染料完全重合,证明PRKCSH定位在内质网上。在DTT处理产生内质网胁迫条件下,PRKCSH出现点状分布现象。为深入探索PRKCSH在内质网途径起的作用,本研究利用酵母双杂交实验,筛选与之互作的蛋白。首先将PRKCSH与pGBKT7构建成融合诱饵载体,验证了pGBKT7-PRKCSHH没有毒性和自激活作用。将该重组诱饵载体pGBKT7-PRRKCSHH与水稻cDNA文库进行融合筛选,在四缺培养基上筛出21个阳性单克隆,将这21个阳性克隆在含X-a-gal/AbA的四缺板进行验证,筛选出10个与PRKCSH相互作用的基因,经测序分析得到5个非重复的基因。验证后得到4个阳性克隆,其基因的登录号分别为FPP合酶、GFA2、RP L23、R5P3E。其中GFA2位于线粒体上,并参与细胞程序性死亡。将PRKCSH与GFA2进行回转验证,互作效果强烈。为进一步探究PRKCSH与PCD的关系,本实验采用原核表达体系表达PRKCSH蛋白。将PRRKCSHH与PET-28a载体构建成融合载体,将融合载体转入大肠杆菌DE-3中。鉴定出的阳性克隆进行扩大培养,经IPTG诱导后用SDS-PAGE胶检测出两条大量表达的带有His标签的PRKCSH蛋白。进过冰上破碎,蛋白电泳检测上清没有目的蛋白,PRKCSH 蛋白以包涵体形式存在。在尿素变性的PRKCSH蛋白中加入含有0.5mML-Arg、1mMGSSG 和 2mMGSH 的 LEBuffer 中进行复性,用 Ni-NTA 柱分离纯化PRKCSH蛋白,经透析袋透析后通过SDS-PAGE电泳检测发现存在两条目的蛋白条带,其大小分别为80kDa和110kDa。分别切下SDS-PAGE胶上两条目的条带,进行质谱鉴定,分析发现这两个蛋白条带都为PRKCSH蛋白。由于该蛋白带有His标签,用Western方法发现110 kDa的蛋白被杂交出含有His标签的条带,而80kDa未被杂交出条带,证明80kDa蛋白是不完整的PRKCSH,而110 kDa蛋白是完整的PRKCSH。原核表达产物为深入研究上述相互作用的机制奠定了基础。综上所述,本研究发现PRKCSH定位在内质网上,通过酵母双杂交证明其与PCD相关的GFA2相互作用,显示PRKCSH也可能参与内质网介导的PCD过程。原核表达产物为深入研究上述相互作用机制奠定了基础。